6种表面活性剂对斑马鱼胚胎发育的毒性效应

刘迎，胡燕，姜蕾，潘波，秦涵淳，林勇

中国热带农业科学院环境与植物保护研究所，海口571101

表面活性剂是一种具有两亲结构、能够吸附在表(界)面上，在加入量很少时即可显著改变表(界)面的物理化学性质，从而产生一系列应用功能的物质［1］。表面活性剂在工农业生产和人类日常生活中占有重要作用，使用量逐年增加［2］，随着环保意识的不断加强以及人们对表面活性剂使用安全性越来越重视，诸多学者开展表面活性剂对环境及环境生物影响的研究，其中多以水生生物为主。郑琰晶等［3］报道十二烷基硫酸钠对卤虫和蒙古裸腹蚤毒性等级分别为低毒和中毒;陈清香等［4］报道十二烷基苯磺酸钠和十二烷基磺酸钠对安氏伪镖水蚤雌雄体具有毒性作用且影响母溞产卵、卵孵化;喻方琴等［5］报道13种季铵盐阳离子表面活性剂对小球藻和斜生栅藻为中等毒性至极高毒性且毒性与烷基链长度有关;白丽蓉等［6］报道十二烷基硫酸钠和十二烷基苯磺酸钠对褐点石斑鱼仔鱼均为高毒物质;孙翰昌等［7］报道十二烷基硫酸钠对草鱼抗氧化酶有毒性效应;李祥英等［8］报道两种季铵盐阳离子表面活性剂1227和C8-10对斜生栅藻的急性毒性为高毒，对大型溞和斑马鱼的急性毒性分别为剧毒和中毒。

在表面活性剂行业中，农药表面活性剂是一个重要的领域，作为乳化剂、分散剂等广泛用于加工乳油、微乳剂、水乳剂等多种农药制剂，对充分发挥农药的药效、安全经济的达到杀虫、除草、杀菌等目的起到重要作用。近年来，随着农药用量的逐年增大，农药表面活性剂的安全性问题日益受到关注。李秀环等［9］研究了39种非离子型、6种阴离子型和3种阳离子型农药表面活性剂对大型溞的急性毒性，结果显示:3种阳离子型表面活性剂急性毒性均为剧毒，非离子型表面活性剂中蓖麻油聚氧乙烯醚、吐温和斯潘系列乳化剂均为低毒，而烷基酚聚氧乙烯醚系列和脂肪醇聚氧乙烯醚系列表面活性剂的毒性稍偏高，大部分阴离子表面活性剂的毒性为中毒。

斑马鱼胚胎毒性技术是各国际标准组织认可的标准毒性测定方法之一，属于致畸效应检验，该项技术成本低、易操作、灵敏度高，特别是具有可记录多项毒性指标的特点［10］，广泛应用于环境科学和生态毒理学领域。近年来以各种化学物质对斑马鱼胚胎发育的影响的报道居多［11-15］，但是农药表面活性剂对斑马鱼胚胎发育的影响却鲜有报道，笔者研究6种常用农药表面活性剂对斑马鱼胚胎发育的影响，以期为常用农药表面活性剂对水生生物风险评估提供科学依据。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 试验用鱼

实验所用斑马鱼亲鱼购于海口市水仙池水族馆，体长约2～3 cm，在本实验室循环养殖系统中驯养2个月，然后将雌雄鱼分开驯养1个月后用于鱼卵采集，饲养期间将成年斑马鱼饲养在经活性炭过滤并充分曝气的水体内，水温保持26±1℃，pH=7.82，总硬度为 82 mg·L-1(以 CaCO3计)。每日喂食2次人工饲料，光照/黑暗周期(h)为14∶10。

1.2 供试药剂

农乳602(苯乙基酚聚氧乙烯醚)、宁乳33#(苯乙烯基苯酚甲醛树脂聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段聚醚)、农乳700号(烷基酚聚氧乙烯醚甲醛缩合物)，OP-10(辛基酚聚氧乙烯醚)，NP-10(壬基酚聚氧乙烯醚)，农乳1602(三苯乙基酚聚氧乙烯聚氧丙烯醚)，均为市售。

1.3 试验仪器

SMZ1000体视显微镜(日本Nikon公司)、PYX-250Q-C人工培养箱(广东韶关科技试验仪器有限公司)、斑马鱼水循环养殖系统(上海海圣工贸有限公司)、AUY220万分之一电子天平(日本岛津公司)

1.4 斑马鱼胚胎采集

试验前一天晚上关灯前将雌雄鱼按1:2配对放入产卵缸中，第二天早上8:00开灯，半个小时后收集胚胎收集完，经两次清洗、去掉粪便和凝结的卵后转移至试验用水(曝气自来水，硬度:82 mg·L－1，pH:7.52)，于26±1℃光照培养箱中培养待用。

1.5 染毒处理

预先配置好10 000 mg·L-1表面活性剂母液，根据预实验结果，依次稀释成一系列梯度浓度进行染毒。胚胎急性毒性试验按照以下浓度进行染毒，NP-10:3、6、9、15、20 mg·L-1;OP-10:6、9、15、20、30 mg·L-1;农乳 700:15、25、40、55、80 mg·L-1;农乳602:30、45、60、80、100 mg·L-1;农乳 1602 和宁乳 33#:60、80、100、120、150 mg·L-1。参照毒性试验结果，胚胎孵化率和畸形率试验按照以下浓度进行染毒，NP-10:2、4、6、8、10 mg·L-1;OP-10:4、6、8、12、16 mg·L-1;农乳700:10、15、25、35、45 mg·L-1;农乳602:10、20、30、40、50 mg·L-1;农乳 1602 和宁乳 33#:30、40、50、60、70 mg·L-1。将 30 mL 染毒液转移到直径为10 cm的培养皿中，每个培养皿放置30颗卵，每处理重复3次，设空白清水对照，随后将培养皿转移到培养箱(26±1℃)培养，光/暗周期为14:10小时。试验采用受精后6 h，用显微镜观察到达囊胚期的胚胎用于染毒试验，染毒后120 h结束，整个染毒周期为6-120 hpf(hour post fertilization)。染毒期间不更换染毒液，及时将死亡卵去除防止污染水质。

1.6 观察指标

染毒结束后，记录斑马鱼胚胎孵化数、畸形数、死亡数，计算斑马鱼胚胎孵化率、畸形率。斑马鱼胚胎死亡的判断:肉眼观察早期胚胎不透明，卵凝结;后期幼鱼无心脏跳动，发育停止。

孵化率(%)=已孵化胚胎/总胚胎个数×100%畸形率(%)=畸形胚胎数/已孵化胚胎数 ×100%

1.7 数据处理及图像采集

利用体式显微镜观察胚胎以及采集图像;通过DPS(7.05)软件计算50%死亡时的剂量-半数死亡有效浓度(LC50);采用Origin7.5软件完成进行数据作图;图片处理采用Photoshop CS4软件完成。

2 结果与分析(Results and analysis)

2.1 六种表面活性剂对斑马鱼胚胎的致死中浓度

表1列出六种表面活性剂对斑马鱼胚胎的致死中浓度，NP-10、OP-10、农乳 700、农乳 602、农乳1602、宁乳33 LC50(120 hpf)分别为 16.44、21.13、55.86、84.46、109.90、120.08 mg·L-1，其中 NP-10对斑马鱼胚胎急性毒性最大，宁乳33毒性最低，两者之间LC50相差7倍多，可见不同种类表面活性剂对斑马鱼胚胎毒性差异很大。三种含有烷基酚基团的表面活性剂NP-10(壬基酚聚氧乙烯醚)、OP-10(辛基酚聚氧乙烯醚)、农乳700(烷基酚聚氧乙烯醚甲醛缩合物)毒性高于其他三种不含烷基酚基团的表面活性剂;其中，含有烷基酚基团的表面活性剂NP-10、OP-10、农乳700 的 HLB 值分别为12-13、13.3-14和14.4，表明亲油性越强，毒性越大;农乳602、农乳1602、宁乳 33 的 HLB 值分别为 13.8、16、16.9，同样亲油性越强，对斑马鱼胚胎的毒性也越大。

2.2 六种表面活性剂对斑马鱼胚胎孵化率的影响和致畸效应

图1分别显示六种表面活性剂不同处理浓度-斑马鱼胚胎孵化率(幼鱼致畸率)效应关系，六种表面活性剂显示出相似的趋势，随着染毒剂量的增加，孵化率逐渐降低，致畸率逐渐提高，表明处理浓度与胚胎孵化率(致畸率)之间存在剂量-效应关系。

图2显示六种表面活性剂诱导斑马鱼幼鱼致畸效应(120 hpf)，其中A、B显示对照组斑马鱼正面和游囊，NP-10、OP-10、农乳700处理组均出现躯干侧翻(C，幼鱼身体不能平衡，倒向一侧)、沉于培养皿底部、游动能力减弱，游囊关闭(D，游囊发育不良或未膨胀)，躯干弯曲症状(E-F，脊椎弯曲);农乳602、农乳1602、宁乳33处理组出现躯干侧翻(C)、沉于培养皿底部、游动能力减弱，游囊关闭(D)症状。

3 讨论(Discussion)

(1)六种表面活性剂对斑马鱼胚胎的致死中浓度显示，NP-10、OP-10、农乳700三种表面活性剂的毒性高于农乳602、农乳1602、宁乳33的毒性，其中NP-10急性毒性最大，宁乳33毒性最低，两者之间LC50相差7倍多，从分子组成看出，NP-10(壬基酚聚氧乙烯醚)、OP-10(辛基酚聚氧乙烯醚)、农乳700(烷基酚聚氧乙烯醚甲醛缩合物)三种均含有烷基酚基团，而烷基酚类化合物(Alkylphenols，APs)属于内分泌干扰物质中重要的一种，具有明显的环境雌激素效应［16］，同时有文献［2］报道烷基酚聚氧乙烯醚(APEO)的毒性普遍高于其他类型的非离子表面活性剂;李秀环等［9］报道烷基酚聚氧乙烯醚系列表面活性剂对大型溞的急性毒性相对较其他类型表面活性剂高，因此推测本实验中毒性较高的三种表面活性剂与含有烷基酚基团有关。

表1 六种表面活性剂对斑马鱼胚胎的致死中浓度Table 1 LC50of six surfactants on zebrafish embryo(120 hpf)

图1 六种表面活性剂对斑马鱼胚胎孵化率和幼鱼畸形率的影响Fig.1 Effects of six surfactants on hatching rate of zebrafish embryo and malformation rate of juvenile fish

(2)表面活性剂的亲水亲油平衡值(HLB值)表示分子中亲水基和亲油基之间的大小和力量平衡程度的量［17］，HLB值越小代表亲油性越强，HLB值越大代表亲水性越强。本实验所用NP-10、OP-10、农乳700 的 HLB 值分别为 12-13、13.3-14 和 14.4，表明亲油性越强，毒性越大;刘在平等［18］亦报道烷基酚类化合物属于次惰性化合物，通过吸收、扩散等方式进入胚胎，首先必须通过由磷脂双分子层组成的胚胎细胞膜才能对胚胎中的靶器官发生作用，所以亲脂性越高的化合物就越容易通过细胞膜，对斑马鱼胚胎的毒性也越大。同时农乳700号(烷基酚聚氧乙烯醚甲醛缩合物)是一种高分子表面活性剂，分子结构大于NP-10、OP-10，推测大分子表面活性剂不易穿透细胞膜，毒性低与分子结构有关。同样，农乳602、农乳1602、宁乳33 的 HLB 值分别为 13.8、16、16.9，亲油性越高，对斑马鱼胚胎的毒性也越大。

图2 表面活性剂诱导斑马鱼幼鱼畸形图;(A)对照正面;(B)对照游囊;(C)表面活性剂处理胚胎躯干侧翻;(D)处理组游囊关闭;(E-F)处理组躯干弯曲Fig.2 Malformation images of surfactant-treated juvenile fish;(A)the control-frontage;(B)the controlswim bladder;(C)body-lean to one side;(D)uninflated swim bladder;(E-F)bent spine

(3)本研究中六种表面活性剂诱导斑马鱼幼鱼致畸效应显示，只有三种含有烷基酚基团的表面活性剂出现躯干弯曲的现象，其他三种并没有出现这种现象，表明躯干弯曲与烷基酚化合物的诱导存在关系，刘红玲等［13］曾报道烷基酚类化合物诱导斑马鱼胚胎产生鱼尾弯曲的现象，而氯代酚类化合物酚不会导致这样的畸形，诱导产生躯干弯曲的相关机理需进一步研究。本研究结果还发现，六种表面活性剂均诱导斑马鱼出现身体侧翻、游囊关闭的现象，斑马鱼的游囊是由两个气囊构成的，后游囊在受精后4.5天开始膨胀而前游囊在21天后开始充气膨胀，游囊的正常膨大对于调控鱼体上浮下沉，提高鱼体取食效率等都有重要的意义［19］，有文献指出斑马鱼幼鱼需要游到水面，呼吸空气以后游囊才能张开［20］，因此推测表面活性剂导致身体侧翻，游动能力降低，无法游到水面呼吸空气，导致游囊无法张开，表面活性剂导致斑马鱼身体侧翻的潜在机制还需通过其他实验进一步进行研究和证实。

六种表面活性剂均为我国目前农药制剂加工常见且大量使用的表面活性剂品种，本实验结果表明，六种表面活性剂均对斑马鱼胚胎产生较高的致死效应和致畸效应，且关于烷基酚聚氧乙烯醚类物质的雌激素效应已有大量报道，因此存在一定的生态毒性风险，所以，在选择使用农药助剂时，除考虑乳化、分散等直接效果外，还应当充分考虑其对环境生物的毒性效应，尽量选用对水生生物毒性较低的农药助剂。

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