南海红树林内生真菌ZH-3代谢产物研究

杨建香，邱声祥，佘志刚，林永成

( 1.中国科学院华南植物园植物资源保护与可持续利用重点实验室，广东 广州 510650；2. 桂林师范高等专科学校，广西 桂林 541001；3. 中山大学化学与化学工程学院，广东 广州 510275）

研究与开发

南海红树林内生真菌ZH-3代谢产物研究

杨建香1,2，邱声祥1，佘志刚3，林永成3

( 1.中国科学院华南植物园植物资源保护与可持续利用重点实验室，广东 广州 510650；2. 桂林师范高等专科学校，广西 桂林 541001；3. 中山大学化学与化学工程学院，广东 广州 510275）

研究南海红树林内生真菌ZH-3的代谢产物。采用反复硅胶柱色谱法、Sephadex LH-20凝胶色谱法等进行分离纯化，并通过理化常数测定和光谱分析鉴定其化学结构。从南海红树林内生真菌ZH-3的菌体中分离得到4个代谢产物，经波谱解析，分别为2-(3-chloro-2,6-dihydroxy-4-methylbenzoyl)-5-hydroxy-3-methoxybenzoate.(1)，3'-dihydroxy-5,5'-dimethyldiphenyl ether(2)，7,8-二甲基苯并[g]蝶啶-2,4(1H,3H)-二酮(3)，5-o-methylbostrycoidin (4)。初步药理活性显示化合物1对人体肝癌细胞hepG2抑制的IC50值为25μg·mL-1。所有化合物均首次从南海红树林内生真菌ZH-3中分离得到。

红树林；内生真菌；代谢产物

由于海洋环境的特殊性, 海洋微生物以其特有的代谢方式, 产生出结构新颖、 具有多种生理活性的化合物, 成为近年来研究的热点[1-5]。 红树林是热带和亚热带沿海地区特有的植物群落 ,一般生长在海岸及河口潮间带泥地里 ,具有十分独特的生理和生态[6]。红树林是海洋微生物的良好栖息地 ,大部分海洋微生物都可在红树林中找到, 但国内外对红树林微生物特别是内生真菌的代谢研究报道极少。本文对南海红树林内生真菌ZH-3代谢产物进行研究，从菌体中分离得到4个化合物：2-(3-chloro-2,6-dihydroxy-4-methylbenzoyl)-5-hydroxy-3-methoxyben zoate.(1)，3,3'-dihydroxy-5,5'-dimethyldiphenyl ether (2)，7,8-二甲基苯并[g]蝶啶-2,4(1H,3H)-二酮(3)，5-o-methylbostrycoidin (4)，通过MS、NMR等波谱分析方法确定它们的结构（图1）。初步药理活性显示化合物1对人体肝癌细胞hepG2抑制的IC50值为25μg·mL-1。

1 实验部分

1.1仪器和试剂

INOVA-500NB超导核磁共振谱仪和INOVA-300NB核磁共振仪；VGZAB-HS双聚焦质谱仪，Thermo DSQ电子轰击电离质谱仪，Thermo MAT95XP高分辨质谱仪；X-4数字显示显微熔点测定仪。

所用试剂均为化学纯，溶剂经重蒸后使用。柱层析硅胶为0.048～0.075mm硅胶，硅胶H， 薄层硅胶GF254。

1.2菌种培养

红树林内生真菌ZH-3采自广东省珠海市，经鉴定为拟茎点霉菌(Phomopsis sp.)，保存于中山大学化学与化学工程学院。发酵培养基为葡萄糖10g·L-1，蛋白胨2g·L-1，酵母膏1g·L-1，粗海盐2g·L-1，pH7.0。650mL三角瓶内装培养基280mL，1.25×105Pa 灭菌25 min后接种120L，在25℃静置培养30d。分别收集发酵液和菌体。

图1 化合物1～4的结构图Fig.1 The structures of compounds 1～4

1.3提取与分离

120L发酵物过滤得菌体和发酵液，发酵液浓缩后用乙酸乙酯充分萃取，菌体用甲醇多次浸泡。提取浓缩物分别以体积比1∶2拌硅胶(0.048～0.075mm)进行柱层析，以石油醚/乙酸乙酯/甲醇进行梯度加压洗脱。收集各组分再经反复柱层析，制备薄层层析，重结晶等方法进行纯化。从菌体粗提物(约15g)分离得到化合物1(15mg)，2(10mg)，3(10mg)，4(12mg)。

1.4细胞毒活性实验

采用MTT法[7]测定了化合物1对人体肝癌细胞hepG2细胞毒的活性。

1.5化合物的实验数据

化合物1：淡黄色针状晶体。1H NMR(500 MHz,CD3OD)：6.96(d,1H,J=2.8)，6.66(d,1H,J=2.8)，6.22(s,1H)，3.71(s,CH3)，3.69(s,CH3)，2.30(s,CH3)。13C NMR (125MHz，CD3OD)：202.1(C)，168.0(C)，160.6(C)，160.0(C)，159.1(C)，158.8(C)，146.2(C)，130.0(C)，127.8(C)，112.7(C)，111.9(C)，109.8(CH)，109.0(CH)，104.4(CH)，56.7(CH3)，52.6(CH3)，21.1(CH3)。EIMS：366 [M+] for C17H15O7Cl。

化合物2：褐色固体，易溶于常用溶剂。1HNMR (300MHz，CDCl3) δ：7.36(OH,brs)，6.40(2H,d,1.5)，6.29(1H,t,1.5)，2.26(3H,s)。13CNMR (300MHz，CDCl3) δ：158.1(C)，156.6(C)，141.2(C)，112.4(CH)，111.5(CH)，103.7(CH)，21.8(CH3)。EIMS m/z [M+]：230，C14H14O3。

化合物3：黄色粉末，mp：298～300℃，1HNMR (DMSO-d6，500MHz)：δ：11.69(s,1H)，11.86(s,1H)，7.91(s,1H)，7.70(s,1H)，2.46(s,3H)，2.48(s,3H)；13CNMR(DMSO-d6,125MHz) δ：150.0(C)，160.6(C)，130.6(C)，138.4(C)，128.7(CH)，144.6(C)，138.9(C)，125.8(CH)，141.6 (C)，146.4 (C)，19.5 (CH3)，20.2 (CH3)。

化合物4： 红色粉末状固体，mp：209～210℃；EIMS：m/z 299；1HNMR (CDCl3，300 MHz) δ：9.42(1H,s)，2.77(3H,s)，7.57(1H,s)，3.99(3H,s)，3.93(3H,s)，6.78 (1H,s)，13.53(1H,s)。13C NMR (CDCl3,75MHz)：δ 188.2(C)，177.4(C)，164.4 (C)， 157.9(C)，155.2(C)，149.3(CH)，148.7(C)，138.2(C)，126.2(C)，118.0(CH)，116.1(C)，111.5(C)，107.9(CH)，57.6(CH3)，56.8(CH3)，25.3 (CH3)。

2 结果与讨论

化合物1：淡黄色针状晶体，在常用溶剂中都可溶。EIMS显示分子离子峰为366，并有氯原子同位素峰，显示化合物中含有1个氯原子，分子式为C17H15ClO7。1HNMR显示化合物有3个苯环氢，2个甲氧基，1个甲基。13CNMR 和 DEPT除给出以上信息外还给出1个酮羰基，1个羧羰基，2个苯环。将化合物数据与文献[8]对照后，得到化合物的结构为2-(3-chloro-2,6-dihydroxy-4-methylbenzoyl)-5-hydroxy-3-methoxybenzoate。

化合物2：褐色固体，EIMS显示化合物的分子量为230，结合核磁数据得到化合物的分子式为C14H14O3，13C NMR显示有7个碳的信号，1个苯环和1个苯环上的甲基，所以分子内存在对称结构，1HNMR与碳谱得到的结论相同，同时显示羟基信号。与文献[9]对照后确定化合物的结构为3,3'-Dihydroxy-5,5'-dimethyldiphenylether。

化合物3：EIMS显示分子量为243，结合核磁数据，推断出该化合物的分子式为：C12H10N4O2，13CNMR和DEPT谱显示有12个碳，其中包括2个酰亚胺羰基(δ160.6×10-6，150.0×10-6)，6个芳香季碳(δ 146.4×10-6，144.6×10-6，141.6×10-6，138.9×10-6，138.4×10-6，130.6×10-6)，2个次甲基碳(δ128.7×10-6，125.8×10-6), 2个甲基碳(δ20.2×10-6，19.5×10-6)，1H NMR谱显示2个活泼的酰亚胺质子δ11.86 (1H，s)，δ11.69(1H，s)，2个芳香质子δ7.91(1H，s)，7.70×10-6(1H，s)，2个甲基质子δ2.48(3H，s)，δ2.46(3H，s)。通过这些信息，进一步与文献[10]对照，确定该化合物为7,8-二甲基苯并[g]蝶啶-2,4(1H,3H)-二酮。

化合物4：黄色粉末状固体，1HNMR谱图显示有7个单峰，1个螯合的羟基峰(δ 13.53×10-6)，3个孤立的芳香质子峰(δ9.42×10-6，7.57×10-6，6.78×10-6)，2个连氧的甲基峰(δ3.93×10-6，3.99×10-6)，1个甲基(δ2.77×10-6)。13CNMR和DEPT谱图显示有16个碳，其中3个CH3，3个CH，10个季碳。EIMS显示分子离子峰m/z为299。结合上面的核磁谱图，可以推出该化合物的分子式为C16H13NO5，不饱和度为11。根据所得核磁数据与文献[11]对照，确定该化合物为已知化合物5-o-methylbostrycOidin。

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[3] XIA Xue kui, HUANG Hua rong, SHE Zhi gang,et al.1H and13CNMR assignments for five anthraquinones from the mangrove endophytic fungus Haloro sellinia sp. (No. 1403) [J]. Magn Reson Chem., 2007, 45(11):1006-1009.

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Metabolites of Mangrove Endophytic Fungus ZH-3 from South China Sea

YANG Jian-xiang1,2, QIU Sheng-xiang1, SHE Zhi-gang3, LIN Yong-cheng3
(1. Key Laboratory of Plant Resources Conservation and Sustainable Utilization , South China Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510650, China; 2. Department of Chemistry and Engineering, Guilin Normal College, Guilin 541002, China; 3. School of Chemistry and Chemical Engineering, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510275, China)

Secondary metabolites of mangrove endophytic fungus No. ZH-3 from South China sea were studied. The compounds were isolated by column chromatography and identified on the basic of physic-chemical constants and spectral analysis. Four metabolites were obtained and elucidated as 2-(3-chloro-2,6-dihydroxy-4-methylbenzoyl)-5-hydroxy-3-methoxybenzoate. (1),3,3’-dihydroxy-5,5’-dimethyldiphenylether（2）, 7,8-dimethylbenzo[g]pteridine-2,4(1H,3H)-dione (3), 5-o-methylbostrycoidin (4). In the preliminary bioassay, 1 show inhibittory activity on the hepG2 cell line with IC50values of 25μg/mL. The four metabolites were obtained from endophytic fungus No. ZH-3 for the frst time.

mangrove; endophytic fungus; metabolites

O 629

A

1671-9905(2014)02-0001-03

国家自然科学基金资助项目(81373293)，国家863计划和支撑计划项目(201473948)，广西教育厅科研项目（201204LX497）

杨建香（1979-），女，汉族，博士，副教授，主要从事天然产物化学研究。电话：020-37082553，E-mail: 791011@126.com

2013-11-22