林丹、毒死蜱对淡水藻类毒性效应的比较研究

邓惜汝，鲜啟鸣，孙成

污染控制与资源化研究国家重点实验室//南京大学环境学院，江苏 南京 210023

农药正越来越广泛的运用于生产中，并且品种不断增加，用量不断增大。目前我国农药使用以有机氯及有机磷杀虫剂为主，它们对生态系统的安全造成了很大的威胁，有机氯（磷）农药进入水环境后往往通过浮游植物的吸收而积累，随后经过食物链的传递、扩大，对水资源的开发利用造成损害（蔡道基，1999）。

林丹是一种高效广谱的杀虫剂，曾经被许多国家包括中国大量使用。林丹不易降解，在土壤和沉积物中能长期残留，2005年11月于日内瓦召开的持久性有机污染物审查委员会第一次会议审议了将林丹列入《关于持久性有机污染物的斯德哥尔摩公约》的提案，认定林丹符合所有《公约》规定的筛选标准（岳瑞生，2001）。许多国家在20世纪70年代已停止林丹的使用，我国从 1983年起停止生产，但作为其他家药的原料还保留着少量的生产。而毒死蜱作为传统的广谱、高效、低残留、毒性相对较低的杀虫剂品种，其市场潜力被普遍看好，目前，全球毒死蜱的市场年销售量约为14万t，国内市场毒死蜱的市场年需求量约为2万t左右。毒死蜱虽然在中国迎来了发展机遇，但是毒死蜱在生产和使用过程中极易造成水、大气、土壤、动植物污染及通过生物富集对人类健康造成威胁等一系列问题（Rack，1993）。

随着对农药污染认识的深入，农药对生态系统的毒性及其机制的研究不断增多，但过去大多报道集中于农药对鸟类、无脊椎类动物、鱼类、哺乳动物的影响及其毒理学研究，对于丰富而重要的微生物的研究却很少（Gonazlez等，2012）。然而，在日常施用农药的过程中，只有约 1%的农药作用于靶生物，其余的或残留于土壤，或通过径流进入水域，影响土壤和水体中的生物（沈国兴等，1999）。由于藻类构成了水生食物链的基础，为无脊椎动物、鱼类、水鸟等生物提供氧气和食物，因此，开展农药对藻类毒性效应的研究是很有必要的。作为水生生态系统的初级生产者，藻类具有结构简单、代谢速度快、对环境变化反应敏捷等特点，且具有同高等生物相似的物理化学特性和酶作用过程，常作为河流环境理化指标的指示生物（Kobrael和White，1996）。藻类生长抑制试验是毒理学生物测定的方法之一，该方法成本低，可在相对较短的时间内评价化学品的毒性，提供有意义的毒性指标，预测化学物质进入环境可能引起的危害（Rack，1993）。

本实验以长江中下游常见的3种淡水藻类铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)、普通小球藻(Chlorella vulgaris)和梅尼小环藻(Cyclotella meneghiniana)为受试生物，测定了林丹和毒死蜱对藻类的7 d生长抑制曲线，得到相应的半抑制质量浓度(EC50)，最低有显著影响有效质量浓度(LOEC)、最高无显著影响有效质量浓度(NOEC)及最大可接受毒性质量浓度(MATC)。研究结果可为评价林丹及毒死蜱的生态风险提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)、普通小球藻(Chlorella vulgaris)、梅尼小环藻(Cyclotella meneghiniana)，均购于中科院武汉水生所淡水藻种库；林丹（纯度w=99.3%）、毒死蜱（纯度w=100%）均购自AccuStandard, Inc.，USA，实验所用试剂均为分析纯。主要仪器有荧光显微镜、智能光照培养箱、超净工作台、冷冻离心机、高压灭菌器、紫外-可见分光光度计、血球计数板等。

1.2 实验方法

1.2.1 藻种培养

铜绿微囊藻和普通小球藻采用BG11培养基培养（陈国永等，2007），梅尼小环藻采用D1培养基培养（杨海明等，1997）。实验前先对藻种进行驯化，将其置于光照强度2000 lx，光暗比12 h∶12 h，温度为25 ℃的恒温培养箱中，每月转接1次。通过镜检能够明显区分3株藻种的形态。

1.2.2 生物量测定

为了准确快速地获得藻细胞的生物量，实验中选用吸光度值来表示3种藻的生长量。将铜绿微囊藻、普通小球藻和梅尼小环藻的藻液稀释至不同质量浓度，用血球计数板在显微镜下计算藻细胞数，同时用分光光度计在680 nm处测量对应藻液的吸光度，可得到藻细胞数与吸光度之间的线性关系。见表1，其中y表示藻液的A680，x表示藻细胞数(104cells·mL-1)。

表1 3种藻吸光度与藻细胞数间的关系Table 1 The relationship between cell number and absorbance

1.2.3 藻类毒性试验

取生长处于对数期的藻液，接种到新鲜灭过菌的培养液中，混匀，记录下起始藻吸光度，然后分装到三角瓶中，分别加入不同质量浓度梯度的林丹(0，50，89，158，281，500 μg·L-1)和毒死蜱(0，500，890，1580，2810，5000 μg·L-1)，每个质量浓度设置 3个平行，用封口膜封口后放入光照强度 2000 lx，光暗比12 h∶12 h，温度为25 ℃的恒温培养箱中，每隔24 h测定藻液在最大吸收波长处的吸光度。

1.2.4 数据处理

本实验选用抑制藻类 50%生长的化合物的有效质量浓度96 h-EC50，最低有显著影响有效质量浓度LOEC、最高无显著影响有效质量浓度NOEC以及最大可接受毒性质量浓度 MATC值作为评价指标。通过 A计算相对抑制率，相对抑制率=(1-N/N0)×100%，其中，N为试验组的藻密度，N0对对照组的藻密度（刘梅和刘赞，1998）。利用概率单位-质量浓度对数法，根据毒物质量浓度的自然对数和生物效应的百分率单位成直线关系这一原理，利用化合物质量浓度的自然对数与抑制百分率之间的相关性方程计算EC50值（Hoekstra，1991）。利用化合物质量浓度的自然对数与抑制百分率之间的相关性方程计算EC20和EC10值，计算得出的EC20可作为LOEC值，EC10可作为NOEC值。最大可接受毒性质量浓度 MATC等于最低有显著影响质量浓度 LOEC和最高无显著影晌质量浓度NOEC的几何平均值，即MATC=(LOEC*NOEC)1/2而计算得出。统计分析用Excel 2007与Origin 8.5软件完成。

2 结果与分析

用不同质量浓度的林丹处理3种淡水藻，林丹对铜绿微囊藻及小球藻的抑制率变化如图1-A—图1-B，由于梅尼小环藻对50~500 μg·L-1的林丹不敏感（图1-C），为了计算林丹、毒死蜱对梅尼小环藻的毒性值，将受试质量浓度范围调整为 500~5000 μg·L-1，林丹对梅尼小环藻的抑制率变化如图1-D。

从图1可知，在林丹的毒性作用下，藻细胞的生长受到不同程度的抑制作用，且抑制程度在一定的线性范围内与林丹的质量浓度呈正相关，显示出明显的质量浓度-剂量相关性。同时，用肉眼可以看出培养在含有不同质量浓度林丹的培养基中的藻类生长情况不同。对照组中，3种藻均生长旺盛，藻液颜色正常，随着时间的增长，藻液的颜色逐渐加深且少有沉淀。而在林丹处理后的培养基中生长的3种藻均随着林丹质量浓度的增加，藻液的颜色明显比对照组浅，沉淀现象严重。

图1 林丹对3种淡水藻类的抑制率变化图Fig.1 The growth inhibition of algae by Lindane

根据图 1的数据，利用前面介绍的概率单位-质量浓度对数法得到回归方程y=ax+b，其中，y为概率单位，x为质量浓度对数。经统计分析，林丹对3种藻的EC50、LOEC、NOEC及MATC值如表2所示。

从表2可以看出，铜绿微囊藻和普通小球藻对林丹的敏感性明显高于梅尼小环藻，先前也有报道指出，不同藻类对农药的敏感性有较大差异。陈碧鹃等（1997）报道了氰戊菊酯和胺菊酯对等鞭金藻的半数抑制质量浓度(96 h EC50)为 1.38和 0.73 mg·L-1；而对小球藻的半数抑制质量浓度(96 h EC50)为0.52和1.12 mg·L-1。从而可以看出，小球藻对氰戊菊酯的敏感性要高于等鞭金藻，对胺菊酯的敏感性低于等鞭金藻。Sabater和Carrasco（2001）研究了哒嗪硫磷对 2种小球藻和 1种蓝绿藻(Pseudanabaena galeata)和2种栅藻的影响，发现2种栅藻比小球藻和蓝藻对哒嗪硫磷敏感。且本实验中计算值与 U.S.EPA 的毒性数据库（http://cfpub.epa.gov/ecotox/）中报道的林丹对铜绿微囊藻的 ρ(LOEC)=300 μg·L-1相近。

不同质量浓度的毒死蜱处理3种淡水藻，3种藻的生长抑制率变化如图2-A—图2-C。

从图 2可知，在当加入低质量浓度的毒死蜱(500 μg·L-1)时，毒死蜱对铜绿微囊藻和普通小球藻的生长具有一定的促进作用，当加入的毒死蜱的质量浓度增加时，逐渐开始对藻的生长表现出抑制作用。随着加入的毒死蜱的质量浓度的升高及3种藻在毒死蜱中暴露时间的增加，毒死蜱的抑制作用越明显。由此可以看出低质量浓度的毒死蜱对藻细胞的生长具有促进作用，而高质量浓度的毒死蜱则对3种藻的生长具有抑制作用，表现出质量浓度-剂量相关性。有许多研究表明，低质量浓度的杀虫剂可促进藻类生长。刘梅和刘赞（1998）以普通小球藻为试验对象，研究了低质量浓度的有机磷农药乐果对其生长的影响，结果显示，低质量浓度乐果能使普通小球藻的生长量、蛋白质含量、叶绿素含量、碱性磷酸酶活力等有明显的增长。邹立等（1998）也发现有些杀虫剂在低质量浓度时对海洋亚心形扁藻有一定限度的促生长作用。

表2 林丹对3种藻的毒性数据值Table 2 The toxicological datas of Lindane on algae

图2 毒死蜱对3种淡水藻类的抑制率变化图Fig.2 The growth inhibition of algae by Chlorpyrifo

根据图2中的数据，经统计分析，毒死蜱对3种藻的EC50、LOEC、NOEC及MATC值如表3所示。从表3可以看出，3种淡水藻对毒死蜱的敏感性强弱依次为铜绿微囊藻、普通小球藻和、梅尼小环藻。

比较表2和表3的毒性数据可知，林丹对藻类的毒性高于毒死蜱对藻类的毒性，如林丹及毒死蜱对铜绿微囊藻的EC50值分别为0.44和2.7 mg·L-1，说明不同的农药对藻类的毒性作用是不同的。邹立等用我国常见的 11种有机磷杀虫剂对海洋亚心形扁藻的毒性效应的研究表明，有机磷农药的质量浓度越高，对扁藻生长的抑制作用越强；他还发现，有机磷农药的毒性大小还与其结构有关（邹立等，1998）。邹立和李永祺用 QSAR模型分析也表明，一般农药的亲脂性越强，电子密度越大，立体结构越复杂，对藻类的致毒效应越大（邹立和李永祺，1999）。高玉荣（1995）研究了杀虫剂单甲脒对绿藻斜生栅藻和蛋白核小球藻的毒性作用，结果表明，同一杀虫剂对不同藻类的毒性也不同。Sabater和 Carrasco（2001）、蔡阿根等（1999）、熊丽等（2002）、Wonk 和 Chang（1988）以及龚瑞忠等（2001）的报道也证实了这一点。

3 结论

总的来说，林丹和毒死蜱这两种典型的有机氯/磷农药对3种淡水藻类均具有一定的毒性效应，且表现出质量浓度-剂量相关性。就两种不同农药而言，林丹对藻类的毒性高于毒死蜱对藻类的毒性，且低质量浓度的毒死蜱对藻类的生长具有一定的促进作用，质量浓度增加后显示出抑制作用，这可能与这两种农药的亲脂性及化学结构有关。而就 3种受试的淡水藻类而言，对于林丹及毒死蜱的敏感性：铜绿微囊藻＞普通小球藻＞梅尼小环藻，说明不同藻类对农药的敏感性有较大差异。林丹和毒死蜱对于淡水藻类毒性差异的原因和机制还有待于进一步的研究。

表3 毒死蜱对3种藻的毒性数据值Table 3 The toxicological datas of Chlorpyrifo on algae

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