活动性关节结核全血γ-干扰素检测结果分析

朱森，黄迅悟，梁艳，彭伟，冯会成，张瑞斐

活动性关节结核全血γ-干扰素检测结果分析

朱森1，黄迅悟2a，梁艳2b，彭伟2a，冯会成2a，张瑞斐1

目的探讨全血γ-干扰素(IFN-γ)检测在活动性关节结核诊断的意义。方法以5种结核分枝杆菌特异性蛋白作为刺激蛋白，应用化学发光酶免疫分吸附法检测35例活动性关节结核病患者及35名健康体检者的全血IFN-γ含量，比较分析5种蛋白刺激时对活动性关节结核检测的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比和阴性似然比，评估其诊断效能。结果CFP10/ESAT6融合蛋白、Rv2041c蛋白、Rv0057/1352融合蛋白、Rv1419蛋白及Rv1656蛋白刺激时，全血IFN-γ检测灵敏性为77.1%、68.6%、71.4%、74.3%和65.7%，特异性为65.7%、54.3%、57.1%、60.0%和62.9%，阳性预测值为62.9%、60%、62.5%、65%及63.9%，阴性预测值为74.2%、63.3%、66.7%、70%及64.7%，阳性似然比为2.25、1.5、1.67、1.86及1.77，阴性似然比为0.348、0.579、0.5、0.429及0.545。结论全血IFN-γ检测对关节结核有一定参考意义，但不能作为活动性关节结核的确诊指标。

关节结核；γ-干扰素；诊断；结核分枝杆菌；特异性蛋白

[本文著录格式]朱森，黄迅悟，梁艳，等.活动性关节结核全血γ-干扰素检测结果分析[J].中国康复理论与实践,2014,20 (12):1175-1178.

近年来，发展中国家关节结核发病率正逐年增加。关节结核早期诊断困难，晚期可导致关节毁损，致残率很高[1]。在临床研究方面，一期人工关节置换能实现关节功能的早期恢复，是治疗活动期关节结核的理想方法。目前细菌学检查是结核诊断的金标准，但检出阳性率较低、耗时长、易造成漏诊，使患者术后康复锻炼和关节功能恢复困难。影像学、结核菌素实验、抗体检查、分子诊断方法等都存在一定的局限性，关节结核诊断还没有一种快速、灵敏和特异性高的诊断方法。

随着检测技术的不断完善，体外γ-干扰素释放试验(interferon-γ release assays,IGRA)作为结核感染辅助诊断技术，已在临床上广泛使用[2]。IGRA从早期的第一代Quanti FERON-TB(QFT)发展到目前的第四代T-SPOT.TB试剂盒，主要用于潜伏结核的筛查，敏感和特异性比结核菌素试验高[3]，为探讨全血γ-干扰素(interferon gamma,IFN-γ)检测在活动性关节结核诊断的意义，本研究选择35例活动性关节结核患者和35名健康人进行比较研究，用5种结核分枝杆菌特异性蛋白刺激，应用化学发光酶联免疫吸附法进行体外IFN-γ检测，评估在活动性关节结核的意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2012年4月～2013年12月解放军309医院骨科收治的35例活动性关节疾病患者作为实验组。纳入标准：患者晚期活动性关节结核，有脓肿、死骨和骨破坏，有结核中毒症状，血沉(ESR)、C-反应蛋白(CRP)增高，患者做手术治疗取得病理标本，临床和病理诊断为关节结核。排除标准：早期结核患者，无结核中毒症状，未做手术治疗血沉(ESR)、C-反应蛋白(CRP)正常，保守治疗的关节结核患者。其中膝关节结核19例，髋关节结核8例，肩关节结核6例，踝关节结核1例，距骨关节结核1例。

同期309医院健康体检志愿者35名为健康对照组。纳入标准：无结核病史，胸片检查肺部无结核病灶，ESR、CRP无异常，近一个月无创伤、手术史。排除标准：患者近1个月有发热、感冒、上呼吸道感染等炎性症状。

两组一般情况比较无显著性差异(P＞0.05)。见表1。

表1 两组一般资料[n(%)]

1.2 实验主要试剂

BD OptEIA Human IFN-γ ELISA SET、阳性对照物PHA 5 mg：SIGMA公司；CFP10/ESAT6融合蛋白、Rv2041c蛋白、Rv1656蛋白、Rv0057/1352融合蛋白、Rv1419蛋白：309医院结核研究所自备；化学发光底物液：北京索莱宝科技有限公司；RPMI Medium 1640：北京索莱宝科技有限公司；无支原体新生牛血清：杭州四季青生物工程材料有限公司。

1.3 方法

1.3.1 标本采集

用绿头肝素钠抗凝管抽取患者新鲜静脉血4 ml。

1.3.2 细胞培养

血液采集后6h内加入刺激物，每份标本设阴性对照孔、阳性对照孔、阴性对照孔和5个蛋白检测孔，每个蛋白工作浓度160µg/ml(终浓度为20µg/ ml)。在37℃温箱培养18～24h。

1.3.3 离心

把培养板从培养箱取出，吸取培养物于1.5 ml离心，3000 r/min，共5min，分离上清。把上清液封存于-80℃冰箱。

1.3.4 抗原包被

用包被液将捕获抗体CaptureAntibody按1∶250稀释为4 μg/ml，每孔加100µl，置4℃冰箱过夜。

1.3.5 封闭

倒掉包被液，用PBS-T(PBS-0.05%Tween20，新鲜配制或3 d内准备)洗板3次，浸泡3min次。最后一次将板拍干。每孔加PBS-10%胎儿牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS热灭活，新鲜配制或3 d内准备)200 μl，37℃孵育1 h。用PBS-T洗板3次，浸泡3min/次，最后一次将板拍干。

1.3.6 加样

每孔加入100 μl分离上清(1∶5稀释)和各浓度标准品，37℃放置2 h，洗板5次，浸泡3min/次，最后一次将板拍干。

1.3.7 加入检测抗体稀释的链亲和素-辣根过氧化物酶(Avidin-horseradish peroxidase conjugate)

10%FBS-PBS 1∶250稀释检测抗体Detection Antibody(Biotinylated Anti-human IFN-γ稀释为4 μg/ml)，再用稀释的检测抗体1∶250稀释链亲和素-辣根过氧化物酶每孔加100µl，置37℃孵育1 h。用PBS-T洗板7次，浸泡3min/次。最后一次将板拍干。

1.3.8 加底物液(Substrate Slution)

用前15min将A与B试剂按1∶1配制底物液，每孔加100 μl，立即放入化学发光分析仪5min后读取发光值，用标准品制作标准曲线，换算标本中IFN-γ的量。

1.3.9 阴阳性的判定

实验组和健康对照组全血中结核特异性IFN-γ水平，以Youden指数(敏感性+特异性-1)最大时IFN-γ含量为活动性关节结核病诊断的临界值，大于临界值判断为阳性，小于临界值为阴性。

1.4 统计学分析

采用SPSS 18.0统计软件进行数据分析，计数资料的比较采用χ2检验，计量资料比较采用t检验。显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 IFN-γ检测的阳性检出率

CFP10/ESAT6融合蛋白和Rv1419蛋白为刺激蛋白时，两组IFN-γ检测的阳性检出率有非常显著性差异(P＜0.01)；Rv0057/1352融合蛋白和Rv1656蛋白为刺激蛋白时，两组FN-γ检测的阳性检出率有显著性差异(P＜0.05)；而Rv2041c蛋白为刺激蛋白时，两组IFN-γ检测的阳性检出率无显著性差异(P＞0.05)。见表2。

表2 5种蛋白刺激时IFN-γ检测在两组中的阳性检出率(%)

2.2 全血IFN-γ检测的敏感性、特异性及诊断指数

CFP10/ESAT6融合蛋白为刺激蛋白时，IFN-γ检测的效能最大。见表3。

2.3 5种蛋白刺激时IFN-γ检测的阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比及阴性似然比的比较

CFP10/ESAT6融合蛋白为刺激蛋白时，IFN-γ检测的阳性结果时为真阳性的概率最大；IFN-γ检测的阴性结果时为真阴性的概率最大。见表4。

表3 5种蛋白刺激时IFN-γ检测的敏感性、特异性及诊断指数

表4 5种蛋白刺激时全血IFN-γ检测的阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比及阴性似然比

3 讨论

人体感染结核分枝杆菌后，体内T淋巴细胞被致敏，再次受到结核分枝杆菌特异性抗原刺激后，致敏T细胞产生IFN-γ[4]。IGRA利用此原理，将结核分枝杆菌感染患者血液经含有结核分枝杆菌抗原的蛋白刺激后，测定T细胞IFN-γ释放反应，可判断患者是否感染结核分枝杆菌。IGRA检测结核感染的方法包括酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)和酶联免疫斑点，该研究应用的化学发光酶联免疫吸附法是改良的ELISA，标本可以重复检测，检测周期耗时短，选取的5种刺激蛋白已在肺结核检测中应用[5-8]。目前国内外常用的结核分枝杆菌特异性蛋白是ESAT-6和CFP-10。本实验选用的CFP10/ESAT6融合蛋白集合了二者的优点，没有卡介苗菌株编码基因，可以避免卡介苗接种后的假阳性结果；Rv1419编码分子量为13 kDa分泌性凝集素，此抗凝素存在于结核分枝杆菌H37Rv培养滤液中，在活动性肺结核诊断中有一定意义；Rv1656蛋白属于结核分枝杆菌H37Rv的全细胞裂解物，是一种改进的抗原，有可能用于鉴别隐性感染者和活动性肺结核。

本研究以CFP10/ESAT6融合蛋白和Rv1419蛋白为刺激蛋白，在实验组IFN-γ检测的阳性检出率为77.1%和74.3%，健康组阳性检出率为34.3%和40.0%，两组比较有非常显著性差异(P＜0.01)；Rv0057/1352融合蛋白和Rv1656蛋白为刺激蛋白时，IFN-γ检测在实验组的阳性检出率为71.4%和65.7%，健康组阳性检出率为42.9%和37.1%，两组比较有显著性差异(P＜0.05)；而Rv2041c蛋白为刺激蛋白时，在实验组和健康组IFN-γ检测的阳性检出率为68.6%和45.7%，两组比较无显著性差异(P＞0.05)。

结核分枝杆菌是胞内感染菌[9]，T细胞不能直接作用于胞内菌，结核分支杆菌感染所致的细胞免疫受多种因素影响，从而影响IGRA。儿童、并发艾滋病病毒(HIV)感染等免疫功能不全患者、应用免疫抑制剂及抗肿瘤坏死因子治疗患者，T淋巴细胞功能受限制，尽管有活动性结核感染，IFN-γ检测也可能阴性。假阴性结果使术后康复的成本增加，不利于患者功能恢复。世界范围内隐性结核感染者超过总人口的1/3，隐性结核感染患者IFN-γ检测会出现阳性结果。此外，某些非结核分枝杆菌抗原与IGRA刺激蛋白抗原相同。这些非结核分枝杆菌感染者、兽医或花农等长期暴露于分枝杆菌环境职业人员，IGRA可以呈阳性反应。假阴性结果使患者不能有效抗结核治疗，患者可能结核感染复发，导致术后康复锻炼和关节功能恢复失败。

实验结果显示，5种蛋白刺激时IFN-γ检测的敏感性和特异性范围为65.7%～77.1%和54.3%～65.7%，此研究结果与国外研究报道QFT试剂盒检测潜伏结核的敏感性为70%～80%[10]、结核酶联免疫斑点检测特异性为58%～61.9%[11]相近，表明IFN-γ检测对活动性结核诊断有一定参考意义，但诊断指数范围为122.9%～142.8%，均小于150%，诊断效能不高。5种蛋白刺激时检测的阳性预测值和阴性预测值范围为60.0%～69.2%和63.3%～74.2%，表明IFN-γ检测的阳性结果不能作为确诊活动性关节结核的指标，阴性结果不能作为排除活动性关节结核的指标。5种蛋白刺激时检测的阳性似然比均小于10，阴性似然比均大于0.1，表明阳性结果诊断活动性关节结核的可能性大，而阴性结果诊断活动性关节结核的可能性小。因此，IFN-γ检测只能作为一种辅助诊断的手段，不能作为确诊指标。

本研究存在很大的局限性，如患者来源受限制，研究的样本量少，可能对实验结果有一定影响。

综上所述，IFN-γ检测对活动性关节结核有一定的参考意义，只能作为一种辅助诊断，不能作为确诊指标。为进一步确诊疾病，应结合病理诊断、临床症状及其相关检查，以便于关节结核患者一期置换，为早期康复和恢复关节功能奠定基础。

[1]黄迅悟,冯会成,孙继桐,等.活动性髋关节结核一期病灶清除全髋关节置换28例报告[J].中华骨科杂志,2013,33(5): 495-500.

[2]Riazi S,Zeligs B,Yeager H,et al.Rapid diagnosis of Mycobacterium tuberculosis infection in children using interferon-gamma release assays(IGRAs)[J].Allergy Asthma Proc,2012,33 (3):217-226.

[3]Abdel-Nabi EA,Eissa SA,Soliman YMA,et al.Quantiferon vs.tuberculin testing in detection of latent tuberculous infection among chronic renal failure patients[J].Egypt J Chest Dis Tubercul,2014,63(1):161-165.

[4]Kik SV,Franken WPJ,Mensen M,et al.Predictive value for progression to tuberculosis by IGRA and TST in immigrant contacts[J].Eur Respir J,2010,35(6):1346-1353.

[5]阳幼荣,冯金栋,张俊仙,等.结核分枝杆菌Rv0057-Rv1352融合蛋白的制备及其初步应用[J].中国生物制品学杂志,2013, 26(6):851-855.

[6]Tan Y,Hu Z,Zhang T,et al.Role of pncA and rpsA Gene Sequencing in Detection of Pyrazinamide Resistance in Mycobacterium tuberculosis Isolates from Southern China[J].J Clin Microbiol,2014,52(1):291-297.

[7]Mazandu GK,Mulder NJ.Function prediction and analysis of Mycobacterium tuberculosis hypothetical proteins[J].Int J Mol Sci,2012,13(6):7283-7302.

[8]De Souza GA,Leversen NA,Målen H,et al.Bacterial proteins with cleaved or uncleaved signal peptides of the general secretory pathway[J].J Proteomics,2011,75(2):502-510.

[9]包二平,黄迅悟,李洪敏,等.结核分枝杆菌与两种人工关节介面黏附特点对比研究[J].中国康复理论与实践,2013,19(6): 510-512.

[10]Lalvani A.Diagnosing tuberculosis infection in the 21st century[J].Chest,2007,131(6):1898-1906.

[11]Riedel S.Procalcitonin and the role of biomarkers in the diagnosis and management of sepsis[J].Diagn Microbiol Infect Dis,2012,73(3):221-227.

Testing Result of Active Joint Tuberculosis's Whole Blood Interferon-γ Assay

ZHU Sen,HUANG Xun-wu,LIANG Yan,PENG Wei, FENG Hui-cheng,ZHANG Rui-fei.Department of Orthopedics,Hebei North University,Zhangjiakou,Hebei 075000,China

ObjectiveTo discuss the significance of the detection of interferon-γ in the diagnosis of active joint tuberculosis.Methods5 kinds of specific proteins of mycobacterium tuberculosis were used as stimulating protein,the chemiluminescence enzyme immunoassay was used to test the content of interferon-γ.The interferon-γ of 35 cases of patients with active joint tuberculosis and 35 cases of healthy people were detected.The difference of the sensitivity,specificity,positive predictive value,negative predictive value,positive likelihood ratio and negative likelihood ratio of 5 kinds of proteins to the diagnostic of active joint tuberculosis were compared.ResultsCFP10/ESAT6 fusion protein,Rv2041c protein,Rv0057/1352 fusion proteins,Rv1419 protein and Rv1656 protein were used as stimulating protein,the sensitivities of active joint tuberculosis by the whole blood interferon-γ assay were 77.1%,68.6%,71.4%,74.3%and 65.7%.The specificities were 65.7%,54.3%,57.1%,60.0%and 62.9%.The positive predictive values were 62.9%,60%,62.5%,65%and 63.9%.The negative predictive values were 74.2%,63.3%,66.7%,70%and 64.7%.The positive likelihood ratios were 2.25,1.5,1.67,1.86 and 1.77.The negative likelihood ratios were 0.348,0.579,0.5,0.429 and 0.545.ConclusionThe detection of interferon-γ has certain significance to joint tuberculosis.But it is not as an index of diagnosing joint tuberculosis.

joint tuberculosis;interferon-gamma;diagnosis;mycobacterium tuberculosis;specific proteins

10.3969/j.issn.1006-9771.2014.12.021

R529.2

A

1006-9771(2014)12-1175-04

2014-04-09

2014-06-14)

首都临床特色应用研究项目(No.Z1211070010112094)。

1.河北北方学院，河北张家口市075000；2.解放军第309医院，a.关节外科，b.结核研究所，北京市100091。作者简介：朱森(1986-)，男，汉族，河北满城县人，硕士研究生，主要研究方向：关节外科。通讯作者：黄迅悟(1963-)，男，汉族，河北玉田县人，主任医师，主要研究方向：关节外科。E-mail:hxw_309@163.com。