乙型病毒性肝炎肝硬化、原发性肝癌患者外周血调节性B细胞检测

孙 健，陈军浩，张 葵，曹小利

乙型病毒性肝炎肝硬化、原发性肝癌患者外周血调节性B细胞检测

孙 健，陈军浩，张 葵＊，曹小利

（南京大学医学院附属鼓楼医院检验科，江苏南京210008）

目的检测乙肝肝硬化、原发性肝癌患者外周血调节性B细胞（Breg）的比率，了解Breg与肝硬化、肝癌疾病之间的关系。方法以CD19＋CD5＋CD1d＋作为Breg标记，流式细胞术检测24例乙肝肝硬化患者、28例肝癌患者和20名健康对照者外周血Breg占B淋巴细胞的比率。结果肝硬化患者组Breg比率（29.90±9.19）%和肝癌患者组Breg比率（31.34±8.99）%均显著高于健康对照组（22.50±6.52）%，分别为P＝0.016和P＝0.003；肝硬化患者组和肝癌患者组间Breg比率无统计学意义（P＞0.05）。结论与对照组比较，Breg比率在肝硬化、肝癌患者外周血中显著升高，提示Breg细胞增加，与肝硬化、肝癌B细胞免疫调节紊乱相关。

调节性B细胞；乙型肝炎；肝硬化；原发性肝癌；流式细胞术

（Chin J Lab Diagn，2014，18：1975）

乙型肝炎病毒（HBV）持续感染是引起乙肝慢性化迁延化及肝硬化（liver cirrhosis，LC）的主要原因，原发性肝癌（primary liver cancer，PLC）与由HBV长期感染导致的大结节性肝硬化有着直接的密切关系。在我国，感染HBV的人群中有10%－20%五年内将发展成肝硬化［1］，90%的原发性肝癌发生在肝炎肝硬化的基础上，其中95%肝癌患者具有HBV感染背景。B淋巴细胞参与调控和（或）诱导T淋巴细胞免疫应答而与肝硬化、肝癌疾病关系密切［2－5］，调节性B细胞（regulatory B cell，Breg）作为B淋巴细胞亚群，其表型CD19＋CD5＋CD1d＋得到国际公认［6］。Breg近年来广受关注，其主要功能是调节炎症过程，抑制过度炎症反应，是免疫排斥、自身免疫病及免疫功能紊乱状态下的重要的保护性细胞，同时也参与肿瘤、感染性疾病的免疫调节，目前在多种疾病中已见Breg的相关报道，但Breg与肝硬化、肝癌疾病的关系未见报道。本文通过对乙肝肝硬化、原发性肝癌患者外周血Breg亚群检测，进一步了解Breg在肝硬化、肝癌疾病中的作用。

1 材料与方法

1.1研究对象24例乙肝肝硬化患者和28例原发性肝癌患者为南京大学医学院附属鼓楼医院已确诊的住院患者。乙肝肝硬化患者男性19例；女性5例，年龄26－72岁，平均年龄53岁，其中HBsAg，HBeAg，HBcAb阳性7例；HBsAg，HBeAb，HB－cAb阳性14例；HBsAg，HBcAb阳性3例，所有患者均经肝组织病理活检以及经临床、生化和影像学诊断明确确诊为LC。原发性肝癌患者男性18例；女性10例，年龄34－76岁，平均年龄56岁，其中19例患者AFP＞1 000ng／ml；6例患者AFP＝20－1 000ng／ml；3例患者AFP＜20ng／ml，所有患者均有LC病史，经病理活检、血清AFP、影像学诊断明确为PLC。20名对照者为鼓楼医院体检健康者，其中男13名；女7名，年龄22－70岁，平均年龄52岁。空腹采集静脉血2.0ml，以乙二胺四乙酸钾（EDTA－K2）抗凝。

1.2仪器与试剂流式细胞仪（BD FACScalibur）；Anti－human CD1d－APC（Clone：51.1）和同型对照Mouse IgG2b－APC为eBioscience公司产品；CD45－PreCP／CD19－FITC／CD5－PE、同型对照IgG1－PE和溶血素（FACSLysing Solution）均为BD Biosciences公司产品；鞘液使用Backman－Coulter公司ISOTONⅢ血细胞稀释液。

1.3检测方法取CD45－PreCP／CD19－FITC／CD5－PE／CD1d－APC单抗各10μl加入流式专用试管底部，以CD45－PreCP／CD19－FITC／CD1d－APC／IgG1－PE各10μl作为CD5－PE同型对照管、CD45－PreCP／CD19－FITC／IgG－APC／CD5－PE各10μl作为CD1d－APC同型对照管。每管加入EDTA－K2抗凝全血100μl，旋涡混匀后，置室温避光反应15 min，然后加入溶血素2.0ml，旋涡混匀，室温避光溶血5min后以1 500r／min离心5min，弃上清液，加入鞘液2.0ml，旋涡混匀后1 500r／min离心5 min，弃上清液，加400μl鞘液，混匀后流式细胞仪检测。

1.4流式细胞仪分析在侧向角（SSC）／CD45设“门”于淋巴细胞“R1”，将其“Format”至另一散点图SSC／CD19上设“门”于B细胞“R2”。另设逻辑门G3＝R1and R2，“Format”G3至CD5／CD1d散点图中，进行Breg（CD19＋CD5＋CD1d＋）亚群检测。用Cell Quest软件获取50000个以上细胞数据，分析外周血Breg亚群的百分率，结果以百分比表示。

1.5统计学方法实验数据使用均数标准差（¯x± s）表示，采用SPSS 16.0统计软件分析，两组间比较采用成组t检验，多组间比较采用单因素方差分析，方差齐时组间比较用LSD检验，方差不齐时用Tamhane’s T2检验。组间P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1流式细胞术检测Breg亚群使用CD45－Pre－CP／CD19－FITC／CD5－PE／CD1d－APC单克隆抗体免疫标记，参照同型对照结果，通过流式细胞术可以清楚检测到Breg（CD19＋CD5＋CD1d＋）亚群表达比率。结果见图1。

图1 流式细胞术分析调节性B细胞亚群散点图

2.2LC患者组、PLC患者组与健康对照组Breg亚群的比较24例LC患者外周血Breg比率（29.90 ±9.19）%和28例PLC患者Breg比率（31.34± 8.99%均显著高于健康对照组（22.50±6.52）%，分别为P＝0.016和P＝0.003；肝硬化患者组和肝癌患者组间Breg比率无统计学意义（P＞0.05）。结果见表1。

表1 调节性B细胞亚群水平比较（¯x±s）

3 讨论

LC和PLC在我国属于常见病、多发病，HBV感染是两者的主要危险致病因素。慢性乙肝－肝硬化－肝癌三步曲的发展转变过程中，相关的免疫学机制复杂，多数研究者认为与机体的免疫应答及调控紊乱有密切的关系。过去许多研究显示，T淋巴细胞免疫功能紊乱是疾病发生发展的重要原因，主要表现为患者外周血CD4＋CD8＋细胞数及比例紊乱［7］；Th1／Th2平衡调节紊乱［7］；Treg和Th17免疫调节紊乱［8，9］。B细胞作为免疫活性细胞主要的功能是产生特异性抗体，在抗感染免疫过程中发挥重要作用。随着研究的不断深入，B细胞其它的功能也越来越多的被揭示。B细胞的免疫调节作用由Wolf等人［10］在研究急性实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）时提出，随后Filatreau等［11］发现B细胞在IL－10缺乏的情况对EAE的发生有促进作用。2006年，Mizoguchi等［12］首先使用调节性B细胞的概念来定义这群具有负向调节功能的B细胞群体。2008年，Yanaba等［5］在研究小鼠CHS模型时首次证实这种特殊细胞亚群的存在，以CD19＋CD5＋CD1d＋为表型特点，也是第一种被证实的Breg亚群。Breg又名B10细胞，通过分泌白介素IL－10诱导Th0细胞向Th2分化、抑制Th1的分化而影响Th1／Th2的平衡，并且抑制Th17细胞的诱导和募集Treg、NKT等抑制性细胞［13－15］，参与介导病毒感染及肿瘤的免疫应答。

目前对于人体Breg表型的研究尚无定论，疾病不同表型不同；同一表型在不同疾病中的作用也不同。Breg可能不仅是某一种特定标志的细胞群，而是多组不同亚群的集合，CD19＋CD5＋CD1d＋亚群是其中主要的代表，我们的实验仅对（CD19＋CD5＋CD1d＋）Breg亚群进行研究。在对外周血Breg占B淋巴细胞的比率分析后我们发现，LC和PLC患者Breg亚群比率均显著高于健康对照组，提示在LC和PLC患者体内不仅存在上文所提的T细胞免疫调节紊乱，而且同时存在B细胞免疫调节紊乱，并且两组患者Breg免疫紊乱的倾向是一致的。导致患者Breg比率升高的原因可能有：①患者体内B细胞数高增殖［2，3］和活化B细胞高表达［4］，反馈性的增加和活化Breg数量；②患者B1（CD5＋B）细胞显著增加［5］，B1细胞分为B1a和B1b，B1a细胞在自身免疫性等疾病的发病和进展中起重要作用并具有产生IL－10的能力，因此多数学者认为Breg源自B1a细胞［16］；③患者存在的T细胞免疫调节紊乱诱使机体产生更多的Breg对抗平衡失调，影响T细胞对病毒感染和肿瘤的攻击。本次研究没有发现LC和PLC患者组间Breg亚群存在显著性差异，原因可能有：①PLC患者经历过或合并有LC疾病，具有与LC相似的免疫环境；②研究的样本量不够多。③外周血部分Breg募集到癌组织中，导致外周血Breg差异不显著。

综上所述，LC和PLC患者外周血Breg亚群均显著升高，提示Breg与肝硬化、肝癌B细胞免疫调节紊乱相关。LC和PLC患者之间Breg亚群比较由于受临床样本量的限制，尚需进行大样本的临床观察以及对肝脏局部组织的研究以进一步了解Breg在LC和PLC间转化的作用与意义。

［1］Liu J，Fan D.Hepatitis B in china［J］.Lancet，2007，369（9573）：1582.

［2］陈柳英，梁 宁，等.肝硬化患者血清CA199、外周血T细胞亚群和B细胞数检测的临床意义［J］.细胞与分子免疫学杂志，2008，24（5）：500.

［3］陈 罡，罗殿中，等.肝癌组织中B淋巴细胞的数量和分布及与临床的关系［J］.广西医科大学学报，2005，22（2）：217.

［4］邓春成，刘晓光，等.肝硬化患者外周血CD19＋CD25＋细胞表达的临床意义［J］.临床肝胆杂志，2006，22（5）：349.

［5］杨瑞宁，李芳秋，等.乙型肝炎患者外周血B淋巴细胞CD5mRNA表达水平的研究［J］.临床检验杂志，2002，20（3）：142.

［6］Yanaba K，Bouaziz JD，Haas KM，et al.A regulatory B cell subset with a unique CD1dhiCD5＋phenotype controls T cell－dependent inflammatory responses［J］.Immunity，2008，28（5）：639.

［7］马寅英，杨广民，等.乙型肝炎患者外周血T淋巴细胞亚群和Th1／Th2类细胞因子的表达及临床意义［J］.现代检验医学杂志，2009，24（1）：132.

［8］王 显，苏智军，等.慢性乙型肝炎患者外周血CD4＋CD25＋FoxP3T淋巴细胞的检测及意义［J］.肝脏，2011，16（3）：222.

［9］李 婕，陈 智，等.原发性肝癌患者外周血Th17与CD4＋CD25＋调节性T细胞表达的相关性研究［J］.中华临床感染杂志，2012，5（5）：257.

［10］Wolf SD，Dittel BN，Hardardottir F，et al.Experimental autoimmune encephalomyelitis induction in genetically B cell－deficient mice［J］.Exp Med，1996，184（6）：2271.

［11］Filatreau S，Sweenie CH，McGeachy MJ，et al.B cells regulate autoimmunity by provision of IL－10［J］.Nat Immunol，2002，3（10）：944.

［12］Mizoguchi A，Mizoguchi E，Smith RN，et al.Suppressive role of B cells in chronic colitis of T cell receptor alpha mutant mice［J］.J Exp Med，1997，186（10）：1749.

［13］Dilillo DJ，Matsushita T，Tedder TF.B10cells and regulatory B cells balance immune responses during inflammation，antoimmuntiy，and cancer［J］.Ann NY Acad Sci，2010，1183（1）：38.

［14］Fillatreau S，Gray D，Anderton SM.Not always the bad guys：B cells as regulators of autoimmune pathology［J］.Nat Rev Immunol，2008，8（5）：391.

［15］Majlessi L，Lo－Man R，Leclerc C.Regulatory B and T cells in infections［J］.Microbes Infection，2008，10（9）：1030.

［16］Shlomchik MJ，Craft JE，Mamula MJ.From T to B and back again：positive feedback in systemic autoimmune disease［J］.Nature Reviews Immunol，2001，1（2）：147.

Detection of regulatory B cells among Peripheral blood from patients diagnosed as primary liver cancer and Hepatitis B with Cirrhosis

SUN Jian，CHEN Jun－hao，ZHANG Kui，et al.（Department of Laboratory，Gulou Affiliated Hospital of Medical College of Nanjing University，Nanjing210008，China）

ObjectiveTo explore the relationship bewteen regulatory B cells（Breg）with liver cirrhosis and Hepatic carcinomaby analyzing the proportions of Bregs.MethodsTaking CD19＋CD5＋CD1d＋as the marker of the Breg，Flow cytometry was implemented to determine the proportions of Bregs among the B lymphocytes from the 24patients with liver cirrhosis，28ones with Hepatic carcinoma and 20Healthy controls.ResultsThe proportions of Bregs among patients with liver cirrhosis and the ones with Hepatic carcinoma were significantly higher than those of the Healthy controls（29.90±9.19%vs 22.50±6.52%，P＝0.016vs P＝0.003），and no significant difference was observed between the proportions among the patients with liver cirrhosis and with Hepatic carcinoma（P＞0.05）.ConclusionThe proportions of Bregs among patients with liver cirrhosis and Hepatic carcinoma were obviously higher than that of healthy controls which indicates that the increase of Bregs may relate to the regulatory disorders of B lymphocytes in the patients with liver cirrhosis and Hepatic carcinoma.

regulatory B cells；Hepatitis B；liver cirrhosis；primary liver cancer；flow cytometry

R735.7

：A

孙健（1969－），男，副主任技师，主要从事临床检验实验及研究工作。

2013－07－17）

1007－4287（2014）12－1975－04

＊通讯作者