多探针荧光原位杂交技术在膀胱尿路上皮癌诊断中的意义

王 芳，田宏伟，丁 辉，祁媚娇

多探针荧光原位杂交技术在膀胱尿路上皮癌诊断中的意义

王 芳1，田宏伟2，丁 辉3，祁媚娇3

（1.兰州大学基础医学院；2.甘肃省人民医院；3.兰州大学第二医院泌尿外科，甘肃兰州730000）

目的探讨多探针荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization，FISH）在膀胱尿路上皮癌诊断的可行性，并探讨其与肿瘤临床分期和病理分级的关系。方法收集经膀胱镜检查诊断为膀胱移行细胞癌35例患者，及10例非肿瘤病人，10例正常人群的新鲜尿液标本，应用FISH检测膀胱尿路上皮癌患者尿液脱落细胞中的3、7、17、9号染色体异常，并进行尿细胞学检测（Urinary cytological examination，UCE）。统计学分析FISH和UCE诊断膀胱癌的灵敏性和特异性，并分析FISH检测染色体突变与膀胱肿瘤分期及分级的相关性。结果多探针联合FISH技术与UCE诊断膀胱癌的灵敏度分别为82.86%和37.14%（P＜0.05），特异度分别为95.0%和100%（P＞0.05）。3、7及17号染色体着丝粒特异性探针及9号染色体长臂2区1带（9p21）的p16位点特异性探针联合应用诊断膀胱癌的灵敏度为82.86%，而单一探针诊断膀胱癌的灵敏度最高仅为65.71%。膀胱癌患者中发生3、7、17号染色体畸变及9号染色体p16基因畸变均与不同病理分级（G1－G3）有关（P＜0.05）；3、7号染色体畸变与临床分期（T0－T4）有相关性（P＜0.05），而17号染色体及9号染色体p16基因畸变与临床分期无相关性（P＞0.05）。结论多荧光探针FISH诊断膀胱尿路上皮癌敏感性高、特异性强、无创，且与肿瘤分期和分级有一定相关性，临床应用价值高。

膀胱癌；荧光原位杂交技术；染色体变异；尿脱落细胞学；分子细胞遗传学

（Chin J Lab Diagn，2014，18：1957）

膀胱癌是泌尿系统较常见的肿瘤之一，其发病率和死亡率呈逐年上升趋势。世界范围内，膀胱癌发病率居恶性肿瘤的第九位，在男性排名第六位，女性排在第十位左右。尿脱落细胞学和膀胱镜检查是当前临床中诊断膀胱癌最常用的方法，其中尿脱落细胞学（Urinary cytological examination，UCE）检查特异性较高，且为无创性检查，但其敏感性较低，尤其对于分期及分级较低的肿瘤。膀胱镜检查的优点是敏感性较高，但缺点是对尚无突出粘膜表面的早期癌诊断的敏感较低，而且是有创性的。

研究报道在膀胱癌中，一些染色体会发生非随机性的改变，包括结构畸变和染色体数目异常。常见结构畸变的染色体有1、3、5、9、11、17、21，数目异常的染色体有1、3、7、8、9、10、11、15、17、Y［1］。其中3号染色体的单体性、7号染色体的三体性、17号染色体的多体性、9q21P16基因的杂合性缺失与膀胱癌的发生及复发有显著的关系，而且在膀胱癌中这几种染色体同时出现异常的比例较高。荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization，FISH）是一种无创的特异性检测尿脱落细胞中染色体异常的技术，近些年受到了越来越广泛的关注［2－5］。本研究选用针对3、7、9、17号染色体的特异性探针，对膀胱癌、非膀胱癌患者和正常人尿液的脱落细胞进行FISH检测，并与尿脱落细胞学检测结果进行比较，同时结合临床分期及病理分级，以探讨多探针FISH技术在膀胱癌诊断及监测中的应用价值。

1 材料与方法

1.1临床患者资料

收集兰州大学第二医院及甘肃省人民医院泌尿外科35例膀胱癌住院患者的新鲜尿液，其中男22例，女13例，年龄26－88岁，中位年龄60岁。所有病例均经膀胱镜检查诊断为膀胱移行细胞癌。肿瘤的临床病理情况（膀胱肿瘤2002TNM分期系统和WHO 1973分级法）：T0－T18例，T212例，T310例，T45例；G114例，G210例，G311例。另设对照组20例（包括泌尿系统良性疾病10例，正常人群10例），以建立染色体的畸变阈值并制定阳性判定标准。所有人组的病例均签署知情同意书，通过伦理委员会批准。

1.2主要仪器和试剂

采用美国UroVysionTM Bladder Cancer Kit（GLP P16／CEPl7／CEP3／CEP7DNA探针），其中CEP3、CEP7、CEP17三个DNA探针分别覆盖3、7、17号染色体的着丝粒区域，CLP P16探针覆盖人类9号染色体长臂2区1带（9p21）的P16基因。3号CEP为红色荧光信号，7号CEP为绿色荧光信号，17号CEP为蓝色荧光信号，杂交到9号染色体长臂（9p21）的P16探针为金色荧光信号。主要仪器有荧光显微镜（Olympus IX81），电热恒温水浴槽、离心机和干燥箱等。RNaseA溶液和胃蛋白酶溶液购自Transgene公司。

1.3标本采集与处理

患者均在膀胱镜检查前行尿脱落细胞学检查和FISH检测。连续3d留取患者晨尿200ml，1h内送检。每份尿样分为2份，分别进行尿脱落细胞学检查和FISH检测，并将其检测结果与最终的膀胱镜病理检查结果比较。将收集到的尿液离心10 min（2 000r／min），弃上清，用37℃水浴预热的胶原酶B（0.5mg／ml）重悬沉淀，并置于37℃水浴中消化20min，离心弃上清，再用KCl（0.075mol／L）重悬沉淀，置于37℃水浴中20min，再加入2ml固定液颠倒混匀后离心，弃上清，再加入固定液重悬沉淀，于室温中静置10min，离心弃上清，重复固定1次，滴片。玻片在56℃老化30min后置入RNA酶溶液（100μg／mL）30min，再放入胃蛋白酶盐酸溶液中10min，用2×SSC溶液室温洗涤2次，每次5min，梯度乙醇脱水，准备变性杂交。

1.4原位杂交及信号观察

将70%甲酰胺与2×SSC溶液混合，置于75℃水浴中预热，然后将玻片置入该溶液中变性10 min，再立即置入预冷至－20℃的75%乙醇中，用梯度乙醇脱水后，晾干备用。将探针置于75℃水浴中变性7min，再置于48℃中备用。晾干的玻片在48℃中预热5min，然后将10ml探针混合液滴于原有脱落细胞滴片处，立即加盖盖玻片，并用封口膜包被，置于43℃湿盒杂交过夜。拆除封口膜，去掉盖玻片，用预热至48℃的50%甲酰胺与2×SSC混合溶液洗涤3次，每次5min，再用2×SSC溶液洗涤10min，用0.1%NP－40细胞裂解液与2×SSC混合溶液洗涤5min，置于暗处晾干后，滴加15μl DAPI荧光染料后封片20min，置于暗处，待观察。每例分析100个间期细胞核，细胞重叠、破损者不计数，微弱杂交信号不计数，细胞内杂交信号间距小于信号点直径2倍者记为1个信号点。观察细胞信号点，统计样本中信号点异常的细胞比例。

1.5尿脱落细胞学检查

将受检患者的尿液标本离心后取脱落细胞制成病理涂片，用显微镜进行观察，每例患者连续留取3 d尿液标本做脱落细胞学检查，发现1次癌细胞即可判定为阳性结果。

1.6统计学方法

用SPSS 15.0软件进行分析统计，计数资料采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1阈值的建立

20例正常人尿液，采用以上方法步骤制备玻片及进行FISH实验，进行阈值测定。阈值是指染色体在正常人发生畸变的最低值，是用于判断染色体畸变的临界值，阈值＝异常信号点细胞数目平均值±3倍标准差。结果见表1。

2.2膀胱癌患者尿液的FISH检测结果

表1 用20例正常人尿液建立FISH阈值

在正常人和非尿路上皮癌患者中，FISH结果显示各探针表现为2红、2绿、2蓝、2金的4色杂交信号（图1A）。在尿路上皮癌患者中，FISH结果可见不同程度的染色体数目异常（图1B，C，D）。3、7、17号染色体畸变表现为多倍体，如三体、四体或多体；9号染色体畸变表现为缺失、单体或者多体。

图1 膀胱癌患者尿液的FISH检测结果。红色为CEP3，绿色为CEP7，黄色为9号染色体GLP P16探针，蓝色为CEP17探针。A，正常。B，C，D均为异常。

2.3尿脱落细胞学和FISH检测结果的比较

35例膀胱癌患者中，FISH阳性29例，尿细胞学阳性13例。FISH和尿细胞学诊断膀胱癌的总敏感性分别为82.86%和37.14%。20例非膀胱癌对照组中19例FISH检测阴性，特异性95%，尿脱落细胞学检查均为阴性，特异性100%，表2。FISH检测诊断膀胱癌的灵敏度明显高于尿脱落细胞学检查（P＜0.01），而两者特异度相比差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.4多探针FISH和单一探针FISH检测结果比较

为了比较多探针FISH和单一探针FISH检测膀胱癌的灵敏度，我们分别用联合探针和四种单一的探针进行了实验。结果表明膀胱癌患者中发生3、7、9号染色体P16基因及17号染色体的畸变率分别为62.86%、51.43%、54.29%和65.71%，均明显低于联合法检测的阳性率（82.86%）（表3），说明四种探针联合应用可明显提高膀胱癌的检出率。

表2 尿脱落细胞学和FISH检测诊断膀胱癌的比较

表3 FISH结果与膀胱癌病理分级、临床分期的关系

2.5FISH结果与膀胱癌病例分级、分期的关系

为了研究膀胱癌患者尿脱落细胞间期核3、7、9、17号染色体的畸变率是否与不同病理分级（G1－G3）及临床分期（T0－T4）有关，我们分别用联合探针及四种探针单独检测了不同病理分级及临床分期膀胱癌患者的染色体畸变率。四种探针联合FISH的灵敏度在膀胱癌病理分级G1、G2、G3分别为42.86%，80%，100%，在临床分期T0－T1，T2－T4分别为62.50%、88.89%，且病理分级和临床分期越高，染色体畸变的阳性率越高（表3）。我们将三个不同病理分级（G1，G2，G3）的CEP3检测的阳性率进行比较，用SPSS15.0进行卡方检验，得卡方值为8.344，P＝0.015，P＜0.05，故认为三个病理分级的CEP3阳性率的差别有统计学意义，说明3号染色体的畸变与膀胱癌的不同病理分级（G1－G3）有关，且病理分级越高，3号染色体畸变的阳性率越高（表3）。用同样的方法，将三个不同病理分级（G1，G2，G3）的CEP7、GLP P16及CEP17检测的阳性率进行比较，结果表明卡方值分别为9.405，6.233及11.413，P值均小于0.05（表3），说明3、7、17号染色体畸变及9号染色体p16基因畸变率均与膀胱癌的不同病理分级（G1－G3）有关（P＜0.05）。

另外，我们还将不同临床分期（T0－T1，T2－T4）分别与四种探针的阳性率比较，进行卡方检验，结果表明3、7号染色体畸变与临床分期有相关性（P＜0.05），而17号染色体及9号染色体p16基因畸变与临床分期无相关性（P＞0.05），见表3。

3 讨论

荧光原位杂交技术作为一项常用的细胞遗传学检测技术，主要用于染色体数目和结构畸变的研究。细胞遗传学的大量研究表明，膀胱癌在其发生发展过程中表现为某些染色体的畸变。近年来，膀胱癌的FISH检测及其临床应用成为研究热点［6］。

本研究采用针对3、7、9、17号染色体的FISH探针，检测并分析膀胱癌的染色体畸变，以探讨FISH在国内膀胱癌的临床应用价值。在本研究中，多探针联合FISH诊断与尿脱落细胞学诊断方法的灵敏度分别为82.86%和37.14%（P＜0.05），特异度分别为95.0%和100%（P＞0.05）。另外，多探针联合FISH的灵敏度在膀胱癌病理分级G1、G2、G3分别为42.86%，80%，100%，在临床分期T0－T1，T2－T4分别为62.50%、88.89%，四种染色体联合畸变程度与肿瘤的病理分级（G1－G3）有相关性（P＝0.006），与文献报告结果［7］相符。

3号染色体的异常在膀胱癌较为常见，约占47.4%，与肿瘤的分级有一定相关性，且常与其他染色体的异常并存，因此可作为肿瘤浸润性的预测指标［8］。7号染色体的畸变在膀胱癌发生、发展中起重要作用，其多倍性的发生率大约为13.0%－76.2%，且其多倍体的倍数与膀胱肿瘤的病理分期、临床分级密切相关，在复发性和浸润性膀胱癌中该染色体的三倍体发生率较高［9］。另外，有研究报道17号染色体的异倍体是膀胱癌进展和侵袭的标志之一，且其异倍体与肿瘤的分期、分级密切相关［10］。在膀胱肿瘤中较常见的染色体变化还有9号染色体的部分或全部丢失，且其与肿瘤的早期发生密切相关，国外研究报道膀胱癌患者9号染色体长臂2区1带的纯合性缺失率高达83%［11－12］。在本研究中，膀胱癌患者中发生3、7、9号染色体P16基因及17号染色体的畸变率分别为62.86%、51.43%、54.29%和65.71%，并发现与病理分级（G1－G3）有明显相关（P＜0.05）；9号染色体P16基因突变中10例（10／19）表现为不全缺失或完全缺失，有9例（9／19）表现为多倍体；3、7号染色体畸变与临床分期（T0－T4）有相关性（P＜0.05），而17号染色体及9号染色体p16基因畸变与临床分期无相关性（P＞0.05），这一结果或许与样本量有关。

3、7及17号染色体着丝粒特异性探针及9号染色体p16位点特异性探针联合应用诊断膀胱癌的灵敏度为82.86%，而单一探针诊断膀胱癌的灵敏度最高仅为65.71%，故四种探针联合应用可明显提高膀胱癌的检出率。

综上所述，使用FISH技术检测患者尿液中3、7、9、17号染色体畸变来诊断膀胱癌，具有无创且敏感度高、特异性强的优点，对尿路上皮癌患者有辅助诊断作用，具有一定的临床应用价值。

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The Significance of Multiprobe Fluorescence in Situ Hybridization in Diagnosis of Urary Bladder Cancer

WANG Fang1，TIAN Hong－wei2，DING Hui3，et al.（1.School of Basic Medicine in Lanzhou University；2.Gansu Provincial Hospital；3.Department of Urology in the Second Hospital of Lanzhou University，Lanzhou730000，China）

ObjectiveTo evaluate the fasibility of multiprobe fluorescence in situ hybridization（FISH）assay in diagnosing urine bladder cancer，and to discuss the relationship of FISH and clinical stages and pathological grades.MethodsFresh urinary specimen was recruited from 35bladder cancer patients who were diagnosed by biopsies，10non－tumor patients，and 10healthy individuals.Exfoliated cells from fresh urinary specimen was collected and analyzed by FISH using centromeric probes of chromosome 3，7，17and region probe of 9p21.Urinary cytological examination（UCE）was applied at the same time.The sensitivity and specificity of each method in the diagnosis of bladder cancer were determined and various chromosomal aberrations and malignant degree of correlation by comparative analysis.ResultsThe sensitivity of mutiprobe FISH and UCE in diagnosing bladder cancer were 82.86%and 37.14%respectively（P＜0.05），the specificity of mutiprobe FISH and UCE were 95.0%and 100%respectively（P＞0.05）.The sensitivity of combine centromeric probes of chromosome 3，7，17and region probe of 9p21together was 82.86%，while the highest sensitivity using one of them was just 65.71%.The aberration frequency of chromosomes 3，7，17and 9p21were positively associated with the pathological grades（G1－G3）（P＜0.05）.Meanwhile，the abnormality of chromosomes 3and 7 were positively associated with clinical stages（T0－T4）（P＜0.05），however，the aberration frequency of chromosomes 17and 9p21were proved not to be correlated with clinical stages of bladder cancer（P＞0.05）.ConclusionMutiprobe FISH has high value for diagnosing bladder cancer because of its high sensitivity，accurate，non－invasive，and relationship with clinical stages and pathological grades.

Bladder cancer；Fluorescence in situ hybridization；Chromosome aberration；Urinary cytological examination；Molecular cell genetics

R737.14

：A

王芳（1982－），女，博士，实验师，主要从事细胞分子医学方面的研究。

2013－09－14）

1007－4287（2014）12－1957－05

中央高校基本科研业务费专项资金自由探索项目（lzujbky－2012－148）；兰州大学实验技术创新基金项目