多因素复合制作病证结合血瘀模型的研究

阎 亮曾意荣樊粤光

(1 河南省中医院，河南 郑州 450002；2 广州中医药大学第一附属医院，广东 广州 510405)

多因素复合制作病证结合血瘀模型的研究

阎 亮1曾意荣2樊粤光2

(1 河南省中医院，河南 郑州 450002；2 广州中医药大学第一附属医院，广东 广州 510405)

目的 探讨通过多因素整合建立大鼠血瘀模型的可行性。方法 将SD老年大鼠40只，随机分为空白组；对照2组，模型2组，每组8只。通过使用肾上腺素联合冰浴来进行大鼠血瘀模型的复制，通过采用定量化打击法来进行大鼠血瘀模型。结果 通过对照组和模型组指标检测发现模型大鼠体征基本符合血瘀症的中医症候特点，同时实验室指标也基本符合血瘀证的诊断。

血瘀模型；病症结合；多种因素

1 材料与方法

1.1 研究材料

1.1.1 动物材料

选取SPF级别的Sprague–Dawley老年大鼠共40只，平均体质量为250～300 g，雌性和雄性各一半，全部从广州中医药大学实验中心购买。

1.1.2 实验试剂

①水合氯醛，批号为090802，由北京化学实验试剂公司提供北京化学试剂公司提供；②肝素钠注射液，批号为091103，由上海第一生化药业公司提供；③大鼠纤维蛋白原酶联免疫吸附测定试剂盒。从上海西唐生物科技公司购买，分装进口。④枸橼酸钠，批号为100321，从广州齐云生物科技公司购买；⑤高脂饲料配方SPF级鼠料，其中进口鱼粉含量8%，蛋白粉含量15%，精炼油含量12%，提供自广州花都区东信华饲养场。

1.2 研究方法

1.2.1 研究模型分组

将大鼠在适应条件下喂养1周左右，状态较好，没有生病和死亡。根据随机化简单原则，一共分成5组。主要为空白组、模型1 d组、模型7 d组、对照1 d组和对照7 d组，每个组的大鼠数量为8只。

1.2.2 研究模型制备

其中对照组与空白组进行常规的SPF大鼠饲料的喂养，时间为2周，模型组进行SPF高脂饲料的喂养，时间同样为2周。喂养时间过后，空白组进行常规饲养，食物和水自由喂养。而对照组通过冷刺激和肾上腺素结合的方法，，在动物皮下将盐酸肾上腺素注射液分两次注入，每次为0.8 mL/kg，时间间隔为4 h。对模型组，通过改良定量化打击法的采用，在手术前大鼠禁食半天，使用10%水合氯醛溶液，根据30 mg/100g的剂量来实施腹腔麻醉，起效时间为2～3 min，在20～45 min之内苏醒。在成功麻醉后，将动物四肢在解剖板上固定，模型组大鼠腹部剪毛，用消毒酒精处理后，在腹部正中线右侧1 cm的地方将皮肤切开，然后将后腹膜剪开，使得右髂总的静脉和动脉显露，且在远端进行进一步分离，使得右股的静脉和动脉显露。用0.5 kg左右重量的金属球，在7 cm左右的高度落下，对大鼠的肌肉和右后支动脉直接撞击[1]。完成撞击以后，仔细观察，排除右股静脉和动脉破裂、骨折的大鼠。然后将伤口冲洗，缝合并关腹。

1.2.3 手术后的管理

手术结束后，模型组的大鼠单独饲养，避免互相撕咬[2]，大约3 h后能自行食用水和食物。空白组进行普通饲料的喂养，模型1组和对照1组大鼠禁食，模型2组进行高脂饲料的喂养，对照2组进行普通饲料的喂食。

1.3 实验指标检测

1.3.1 中医证候观察

采集标本前，观察大鼠体征是否符合血瘀证诊断标准[3]。

1.3.2 实验指标检测

造模后第1天，将空白组、对照1组和模型1组，使用10%的水合氯醛溶液，剂量为30 mg/100g实施腹腔麻醉，然后进行腹主动脉采血，大约抽取8 mL，将4 mL放入装有3.8%枸橼酸钠抗凝剂的试管中，其他的放入经肝素钠抗凝采的血管中。①D-二聚体的检测：首先，从事先采集的经3.8%枸橼酸钠抗凝的4 mL样本中拿出2 mL，半小时内在1000×g，2～8 ℃的情况下进行离心，15 min后，将上清取出，在-20 ℃的环境中保存并备用。通过双抗体夹心ELISA法的采用来实施D-二聚体检测。②纤维蛋白原检测：通常利用双抗体夹心ELISA法在18～25 ℃的环境下实施纤维蛋白原检测。③凝血酶原时间及活化部分凝血活酶时间的测定：使用剩下的经3.8%枸橼酸钠抗凝的血液，半小时以内，离心15 min左右，使得血小板血浆分离，在1 d内通过全自动血凝仪来进行凝血酶原时间和活化部分凝血活酶时间的测定。

1.3.3 实验数据统计

通过SPSS17.0来进行统计学分析，期中计量资料用均数±标准差（）表示，并进行正态性分布和方差齐性检验根据α=0.05标准。如果与方差齐和正态分布符合，则使用t检验，如果不符合，则使用近似t检验，由于P＜0.05，具备统计意义。

2 结 果

2.1 中医证候观察

在造模过程中，大鼠没有发生死亡，空白组没有出现异常；造模以后，模型组出现饮食减少、畏光、皮下瘀斑、肢体肿胀等现象；对照组出现肢体暗红、躁动、畏寒等现象。

2.2 D-二聚体的检测

表1 造模后各组D-二聚体值[（），mg/L]

表1 造模后各组D-二聚体值[（），mg/L]

指标 空白组 对照组 模型组1组 2组 1组 2组例数 8 8 8 8 8 D-二聚体值 0.37±0.120.68±0.090.41±0.140.66±0.070.55±0.10

从表1可看出，在造模1 d以后，模型1组与对照1组的D-二聚体值和空白组比较，略有升高。在造模7 d后，对照2组的D-二聚体值基本正常，和空白组相比，没有统计学差异。而模型2组的D-二聚体值和第1天相比，略有下降，且具有统计学意义。

2.3 纤维蛋白原的检测

表2 各组大鼠纤维蛋白原值[（），g/L]

表2 各组大鼠纤维蛋白原值[（），g/L]

指标 空白组 对照组 模型组1组 2组 1组 2组例数 8 8 8 8 8纤维蛋白原 2.38±0.633.67±0.752.41±0.673.51±0.823.07±0.54

见表2。在造模1 d后，模型1组与对照1组相比空白组，纤维蛋白原含量有所升高，且具备统计学意义。在造模7 d后，对照2组与对照1组比较，纤维蛋白原含量显著降低，具备统计学意义，但相比空白组不具备统计学意义。模型1组和2组互相比较，纤维蛋白原含量无统计学意义，且比对照2组和空白组明显高。

2.4 凝血酶原时间及活化部分凝血活酶时间的测定

表3 各组大鼠PT和APTT比较[（），s]

表3 各组大鼠PT和APTT比较[（），s]

指标 空白组 对照组 模型组1组 2组 1组 2组例数 8 8 8 8 8 PT(s) 18.7±1.8 13.8±1.4 18.9±2.1 12.9±2.7 15.9±3.2 APTT(s) 23.2±2.4 17.3±1.7 23.7±1.9 16.6±2.3 20.1±2.8

从表3得知，造模后1 d，对照组和模型组的APTT与PT缩短，具备统计学意义，造模7 d后，相比对照1组，对照2组的APTT与PT延长，具备统计学意义。模型2组的APTT与PT相比空白组较小，具备统计学意义。提示造模7 d后，模型组的血液还在高凝状态，对照组的血液基本正常。

3 讨 论

血瘀症是临床常见的症型，活血化瘀治疗师目前中西医研究最深入和活跃的领域。目前来说，血瘀症的动物模型有三种研制方法，一种是按照血瘀的病理，例如气虚、郁怒和外伤等来建立；另外一种是按照血瘀症的生理异常，例如血流变的异常来进行动物模型的制作。动物模型通常分为相似性、模拟性和替代性三种层次，模型成功建立的条件如下：①模型和原型间具备相似关系；②原型可以被模型替代；③通过研究模型能得到原型信息。对于中医动物模型来说，原型指的是具备中医特色病症和中医症候的一些病理反应。较为成功的动物模型应该在体征、症状、特殊性检查、治疗反应和实验室等方面做好工作。

因为单一因素的造模对血瘀症的病理病因无法反映，所以应该进行包含多种因素的复合造模，从各方面反映出血瘀症的内在本质，使得动物模型在反映中医证候特点的同时，可以和当代医学的一些病症病例过程保持一致。

临床患者由于血液运行速度太慢或停滞而出现血栓，通常由于外伤、气滞和气虚导致。本研究的目的是利用多因素复合来进行患者血液高凝、高浓和高黏状态的模拟，因此在血瘀模型的建立时，在总结学习其他人造模方式的前提下，选择老年的SD大鼠，进行持续两周的高脂饲料喂养，然后利用定量打击法来造模，对外伤、气滞和气虚等导致血瘀的因素进行模拟，通过分析观察造模以后大鼠的APTT、PT、纤维蛋白原、D-二聚体、局部表征等指标，证明本研究所用的造模方法，在造模以后大鼠在具备血瘀的中医症候特征的同时，实验室的指标也和血瘀症的相关诊断较为符合。但从另一方面讲，临床上血瘀症患者的病因和病例比较复杂，本研究在研究造模后的大鼠静脉血管变化特征时没有从病理角度考虑，今后有待进一步研究，并不断的完善和改进。

[1] 陈奇.中药药理研究方法学[M].3版.北京:人民卫生出版社,2011: 438-439.

[2] 廖福龙.外伤致血瘀的大鼠模型(基础理论研究特集)[J].北京:中西医结合杂志,1989:31-38.

[3] 符为民,涂晋文,熊宁宁,等.实用中医瘀血病证治[M].北京:人民卫生出版社,2006:157-158.

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1671-8194（2014）20-0100-02