超早期针刺百会、水沟对急性脑缺血大鼠GLUT1、GLUT3的影响*

黄 伟 姜功道 李 佳吴 松

（1.湖北中医药大学，湖北 武汉 430000；2.湖北省中医院，湖北 武汉 430061）

超早期针刺百会、水沟对急性脑缺血大鼠GLUT1、GLUT3的影响*

黄 伟1，2姜功道1，2李 佳1△吴 松1

（1.湖北中医药大学，湖北 武汉 430000；2.湖北省中医院，湖北 武汉 430061）

目的在前期采用microPET观察到超早期针刺对脑缺血葡萄糖代谢改善的基础上，从能量代谢角度进一步探讨针刺抗脑缺血损伤的作用机理。方法采用微创开颅电凝法制作大鼠急性脑缺血模型，随机数字表法分为4组：正常组、模型组、穴位组、非穴位组，每组10只。穴位针刺取百会、水沟针刺（频率120次/min，捻转泻法1min，每次5min，留针30min）。非穴位针刺分别在百会、水沟左侧旁开5mm处进针，避开穴位，手法同穴位针刺。采用免疫组织化学法检测缺血侧皮质区域GLUT1、GLUT3的表达。结果造模成功后，缺血侧皮质区域GLUT1、GLUT3含量在大鼠脑缺血后明显下降，与正常组比较，有极显著性差异（P＜0.01）；穴位组大鼠GLUT1、GLUT3含量较模型组及非穴位组比较明显升高（P＜0.05）；而非穴位组与模型组水平接近（P＞0.05）。结论穴位针刺可以有效调节脑缺血大鼠缺血侧皮质区域GLUT1、GLUT3的表达，改善能量代谢，发挥抗脑缺血损伤的作用，进一步为临床针刺抗脑缺血提供实验依据。

针刺脑缺血能量代谢百会穴水沟穴

脑血管病是针灸疗法的主要适应证，但针刺对缺血区域的能量代谢的作用机制还不明确。脑缺血损伤后需氧代谢衰减，无氧酵解增强，很快进入衰竭期，引起兴奋性氨基酸释放，发生早期脑水肿、脑功能活动障碍，继而发生一系列病理反应［1］。因此，能量代谢障碍是脑缺血损伤的基础。笔者前期的研究提示，针刺“百会”、“水沟”可显著改善缺血脑区的能量代谢［2］。因此，本实验通过观察针刺对葡萄糖转运相关因子GLUT1和GLUT3表达的影响，探讨GLUT1和GLUT3在针刺抗脑缺血损伤的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物分组选用SPF级雌性SD大鼠40只，3月龄，体质量200～250g，由浙江省医学科学院动物中心提供，许可证号：SCXK（浙）20030001。动物饲养于温度（20～25℃）和湿度（45％～55％）相对较为恒定的IVC独立大鼠笼具内，。每笼4只，动物可以自由摄食和饮水。随机数字表法分为4组，正常组、模型组、穴位组、非穴位组，每组各10只。

1.2 急性脑缺血模型制作参照Bederson和薛静等方法，采用微创开颅法电凝大脑中动脉，制作大鼠急性脑缺血模型［3-4］。大鼠称体质量，按0.40mL/100 g取10％水合氯醛腹腔注射麻醉，仰卧位固定，于右侧耳和眼球连线的前1/3和后2/3交界处切开皮肤约1.5 cm切口，剔除组织，暴露颧骨和颞骨，用牙科钻在颞骨处钻一深约2mm的小孔，勿伤及大脑皮层，用止血钳和弯镊慢慢剥离颞骨骨片，暴露脑膜，寻找大脑中动脉（MCA），充分暴露后，用单极电凝器凝断MCA，检查断端，用消毒棉球填充，缝合皮肤。按照Bederson［3］神经缺损体征评分标准对大鼠进行评分，≥1级视为造模成功。

1.3 治疗方法参照《实验针灸学》［5］，百会取穴在顶骨正中，用30号0.5寸华佗牌毫针向前沿皮刺0.5～1.0 cm，水沟取穴在唇裂正中、鼻尖下1mm处，相同毫针自穴位处向鼻中隔方向斜刺0.2～0.3 cm。采用泻法，左手持水沟、右手持百会针柄，以120次/min左右进行捻转泻法，每5分钟1次，每次1min，留针30min。非穴位组分别在百会、水沟左侧旁开约5mm处进针，避开穴位，手法同穴位针刺。穴位组及非穴位组在24 h再针刺1次，针刺操作由同一人完成。正常组与模型组正常喂养，不予针刺。

1.4 标本采集及检测动物麻醉并迅速开胸，暴露心脏，用眼科剪剪破心尖部，用灌胃针头经左心室穿刺至主动脉，用止血钳将灌胃针固定，同时剪开右心耳，慢速流水冲洗。打开滴管，先以生理盐水（4℃）250mL快速冲管，以清除血液，再灌注4％多聚甲醛溶液（4℃）500mL，先以150mL快速灌注，再以350mL缓慢滴注。灌注完成后，迅速断头取脑，小心去除脑膜，修块后入4％多聚甲醛溶液固定过夜，24 h内包埋。取视交叉前1 mm及视交叉后6mm进行切片，每片6μm，用多聚赖氨酸固定于载玻片上。参照George Paxinos大鼠脑立体定向图谱选取缺血所在区域，HE染色确定观察部位［6］。采用Axiovert40CFL显微镜和HPIAS-2000彩色病理图像分析系统进行图象采集和分析，测量大脑颞叶皮质免疫阳性反应物的平均光密度值（MOD），每张切片的每个部位测3个视野，100倍镜下检测各片的OD值，分别测定，累加取均值。

1.5 统计学处理应用SPSS16.0统计软件。计量数据以（±s）表示，采用方差齐性检验和单因素方差分析，两两均数比较采用LSD检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 针刺对各组大鼠缺血皮质GLUT1表达的影响见表1。其余3组大鼠缺血侧皮质区域GLUT1免疫阳性物MOD值明显高于正常组（P＜0.05）。穴位组与模型组比较，阳性表达明显增加（P＜0.05）。穴位组GLUT1阳性表达较非穴位组明显增加（P＜0.05），而非穴位组与模型组比较无显著差异（P＞0.05）。上述结果表明，缺血后GLUT1阳性表达增加；穴位针刺可以明显增强大脑皮质GLUT1阳性表达，而非穴位组表达略有增加，但无显著差异（P＞0.05）。

表1 各组大鼠缺血皮质GLUT1表达比较（±s）

表1 各组大鼠缺血皮质GLUT1表达比较（±s）

与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；与穴位组比较，▲P＜0.05。下同。

组别n MOD值正常组10模型组10穴位组10 0.217±0.037 0.303±0.057* 0.406±0.081*△非穴位组10 0.318±0.063*▲

2.2 针刺对各组大鼠缺血组织皮质GLUT3表达的影响见表2。其余3组大鼠缺血侧皮质区域GLUT3免疫阳性物MOD值明显高于正常组（P＜0.05）。穴位组较模型组比较，阳性表达明显增加（P＜0.05）。穴位组GLUT3阳性表达较非穴位组明显增加（P＜0.05）；非穴位组与模型组比较无显著性差异（P＞0.05）。上述结果表明，缺血后GLUT3阳性表达增加；穴位针刺可以明显增强大脑皮质GLUT3阳性表达，而非穴位组表达略有增加，但差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 各组大鼠缺血皮质GLUT3表达比较（±s）

表2 各组大鼠缺血皮质GLUT3表达比较（±s）

组别n MOD值正常组10模型组10穴位组10 0.307±0.071 0.415±0.090* 0.570±0.104*△非穴位组10 0.468±0.091*▲

3 讨论

缺血缺氧脑组织的能量供应主要依赖葡萄糖的无氧糖酵解，而葡萄糖的摄取是无氧糖酵解的限速步骤，在缺氧缺血条件下，神经元能否从细胞外获得足够的葡萄糖是神经元获得缺氧缺血耐受性的关键［7］。葡萄糖转运蛋白是细胞摄取葡萄糖、穿过血液-组织屏障的最基本的载体，负责神经元的葡萄糖转运［8］。脑内能量代谢的特点使得脑组织对循环中葡萄糖的持续供给具有依赖性，因此，GLUT1基因和GLUT3基因在脑组织能量代谢过程中的作用显得尤突出［9］。脑缺血后，缺血、缺氧状态总是与缺乏能量相关，大脑对缺血、缺氧最敏感，在缺氧缺血的情况下，脑内能量代谢由有氧氧化转为无氧酵解，需要消耗大量的葡萄糖，除了能量代谢方式发生改变外，细胞还出现许多适应性变化，如增加线粒体利用氧的能力、酶活性的改变，降低代谢等等［10-11］。GLUT1和GLUT3的合成增加即为适应这种变化，是机体出于自身生存需要的一种反应［12］，这既可认为是一种急性防御反应，又反映脑缺血缺氧后葡萄糖利用需求增加，GLUT1表达的增加使葡萄糖的摄取能力增强，加快葡萄糖的转运，有利于葡萄糖从血液经血脑屏障转运入脑组织，使而葡萄糖氧化生成的ATP水平提高，满足能量代谢的需要，抑制细胞凋亡，延迟能量衰竭引起的级联反应［13］。GLUT3表达的增加则有利于葡萄糖自脑间隙转运入神经元，增强葡萄糖摄取，改善能量代谢，是细胞的保护性反应［14］。

目前，针刺疗法作为一种非药物疗法，已经被公认广泛用于脑血管病恢复期治疗，并且已被越来越普遍地应用于缺血性卒中急性期治疗，具有肯定的疗效［15］。笔者在前期的microPET实验中观察到［2］，针刺百会、水沟能够明显改善急性脑缺血模型大鼠缺血皮质区的葡萄糖代谢，超早期针刺能够有效恢复血供。为求证进一步的科学依据，笔者采用免疫组织化学法探索针刺改善缺血区葡萄糖代谢的可能机制。本研究结果表明，超早期针刺可以有效调节脑缺血大鼠缺血侧皮质区域GLUT1、GLUT3的表达，改善能量代谢，发挥抗脑缺血损伤的作用，进一步为临床针刺抗脑缺血提供实验依据。

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Effect of Ultra Early Acupuncture on Baihui（DU20），Shuigou（DU26）in GLUT1 and GLUT3 of Rats with Acute Cerebral Ischem ia

HUANGWei1，2，JIANG Gong-dao1，2，LIJia1，et al.1 Hubei University of Chi-

nese Medicine，Hubei，Wuhan 430000，China；2 Hubei Provincial Hospital of TCM，Hubei，Wuhan 430061，China

Objective：To study on themechanism of anti cerebral ischemia acupuncture from the earlymicro-PET observation and the very early stage of cerebral ischemia acupuncture which improved glucosemetabolism. Methods：Themodel of acute cerebral ischemia in ratsmade by minimally invasive craniotomy electrocoagulationthe were random ly divided into 4 groups such as the normal group，themodel group，the acupuncture group，the non-acupoint group with 10 rats in each group.Acupoint acupuncture involved Baihui（DU20）and Shuigou（DU26）acupuncture（frequency at 120/min，twirling reinforcing-reducing for 1min and retaining the needle for 30min）.Non-acupoint acupuncture needle were Baihui（DU20）and Shuigou（DU26）respectively in its left side about 5 mm，avoiding the acupoints.The needle way was the same with acupoint acupuncture.Expressions including GLUT1 and GLUT3 were detected by immunohistochemistry in ischemic cortex.Results：After the success ofmodeling，the count of ischemic cortex area GLUT1 and GLUT3 were decreased obviously in rats after cerebral ischemia，compared with the normal group，there is a significant difference between 2 groups（P＜0.01）. The content of GLUT1 and GLUT3 in acupoint group rats compared with model group and non-acupoint group were increased obviously（P＜0.05）.But non-acupoint group compared with model group，there was no significant difference in the above index（P＞0.05）.Conclusion：Acupuncture can improve the ischemic rat cerebral ischemia cortex area energymetabolism，actagainst cerebral ischemia injury，and further for clinical acupuncture in treating cerebral ischemia provide experimental basis.

Acupuncture；Cerebral ischemia；Energymetabolism；Baihui（DU20）；Shuigou（DU26）

R245.2

A

1004-745X（2014）01-0051-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.01.024

湖北中医药大学科研课题（201014）△通信作者

2013-09-04）

·研究报告·