头针对大鼠局灶性脑缺血再灌注后脑组织Ang-1 mRNA的影响*

杨 敏 陈邦国 梁 超 张晓明

（湖北中医药大学，湖北 武汉 430065）

头针对大鼠局灶性脑缺血再灌注后脑组织Ang-1 mRNA的影响*

杨 敏 陈邦国 梁 超 张晓明

（湖北中医药大学，湖北 武汉 430065）

目的观察头针治疗对大鼠局灶性脑缺血再灌注后脑组织内血管生成素（Ang）-1 mRNA表达的影响，探讨其变化规律并分析脑缺血后Ang-1在缺血性脑卒中发病中的作用机制。方法大鼠随机分为正常对照组、假手术组、模型组和治疗组，治疗组又分为缺血再灌注后6、24、48、96 h组，采用改良线栓法制作永久性大脑中动脉闭塞模型，RT-PCR技术检测各组大鼠脑组织缺血半影区内Ang-1 mRNA的表达水平。结果正常对照组、假手术组Ang-1 mRNA中等量表达，与模型组比较，头皮针组各时间点大鼠脑组织Ang-1 mRNA含量增多，其中脑缺血再灌注48 h Ang-1 mRNA含量达高峰，与模型组比较，差异有统计学意义（P＜ 0.05或0.01）。结论Ang-1可能在局灶性脑缺血后与其他血管特异性生长因子共同参与缺血半影区的新血管形成，有利于缺血半影区脑组织功能恢复。

局灶性脑缺血再灌注血管生成素-1逆转录聚合酶链反应

脑缺血后，血管新生是脑微循环修复重建的重要病理生理过程。血管新生程度对卒中后神经功能恢复有非常重要的作用，而血管特异性生长因子在生产新的血管过程中起着尤为重要的作用。Ang是一族分泌型的生长因子，是一族特异性作用于血管内皮细胞的生长因子，最近的研究发现血管生成素-1（Ang-1）可以减轻脑缺血后血脑屏障的渗漏、减小梗死体积［1］。本研究通过观察大鼠局灶性脑缺血再灌注后脑组织Ang-1的表达，观察头针对血管新生的影响，进一步为头针治疗缺血性脑卒中提供相关理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组健康成年SD雄性大鼠100只（华中科技大学同济医学院实验动物中心提供，清洁级），体质量（200±20）g。随机分为正常对照组、假手术组、模型组和治疗组，模型组和治疗组又分为缺血再灌注后6、24、48、96 h组，每组10只。大鼠术前禁食不禁水。

1.2 模型制备大鼠大脑中动脉梗死（MCAO）模型参照Nagasawa、Zea Longa等报道的方法［2-3］并加以改进。参照Zea Longa的5级评分标准［3］对实验动物神经功能缺损进行评分。0级为无神经功能丧失；1级为左前肢不能充分伸展；2级为向左环行运动，轻度局灶神经功能丧失；3级为向左侧倒，中度局灶神经功能丧失；4级为不能自然行走，重度局灶神经功能丧失，只有神经功能障碍在1级以上的大鼠才能保留下来。假手术组大鼠暴露颈内、颈外动脉后即缝合，其余处理同手术组。正常对照组大鼠不予处理，正常给水给食。

1.3 头针方法治疗组予头针治疗，选穴依据《头针国际标准化方案》，选取顶颞后斜线，顶颞前斜线。大鼠穴位定位根据华氏等介绍的大鼠穴位图谱，模拟人体经穴定位［4］。顶颞后斜线为百会至曲鬓（百会穴在顶骨正中点，曲鬓穴为耳缘直上与耳尖水平线的交点）；顶颞前斜线为顶颞后斜线向前平移0.1寸。用28号1寸华佗牌不锈钢针，与头皮呈30°夹角透刺0.5～0.8寸，快速捻转至针下沉涩感后，接韩氏治疗仪，采用疏密波，频率2Hz/100Hz，强度2mA，每次30min，每日1次。

1.4 标本采集与检测治疗组动物按分组情况至规定时间后，以10％水合氯醛足量麻醉，断头取脑，迅速在冰盘上剥离脑膜，除去嗅球、延髓和小脑，分离右侧大脑皮层，仔细切取缺血灶区域大脑皮层组织块，模型组取与治疗组对应区域脑组织，放入冻存管液氮中保存。正常对照组及假手术组在缺血组对应时间点断头取脑，其余操作与治疗组相同。采用RT-PCR检测Ang-1 mRNA表达水平。Ang-1：F：5′-AGAGGCAGTA CATGCTAAGAATT-3′。R：5′-TCCATGGTTTTGTCCCGCAG-3′。β-actin：F：5′-GTGGGGCGCCCCAGGCA CCA-3′；R：5′-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3′。应用UVP计算机图像扫描分析系统测定所检测基因表达水平，以β-actin为内参照，计算所检测基因的相对含量。

1.5 各组神经功能缺损程度评分参照文献［5］制定。

1.6 统计学处理应用SPSS11.0统计软件。计量资料以（±s）表示，组内各时间点间灰度值比较采用方差分析，组间相对灰度值比较采用Dunett T检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组神经功能缺损评分的比较见表1。正常对照组、假手术组与模型组、头针组在各时相上比较，差异均有统计学意义（P＜0.01）；模型组动物神经缺损症状随着时间延长逐渐减轻，但差异无统计学意义（P＞0.05）；头针组与模型在各时相上的NSS比较，差异有统计学意义（P＜0.05），以脑缺血再灌注24 h时较为明显。

表1 各组大鼠脑缺血后神经功能缺损程度评分比较（分，±s）

表1 各组大鼠脑缺血后神经功能缺损程度评分比较（分，±s）

与模型组同时间点比较，*P＜0.05，**P＜0.01。下同。

组别n 6 h 24 h 48 h 96 h正常对照组10假手术组10模型组10 0 0 0 0 0 0 0 0 2.10±0.55 2.30±0.67 2.10±0.57 2.03±0.47治疗组10 2.02±0.26 1.92±0.57**1.70±0.48**1.30±0.48**

2.2 Ang-1 mRNA的表达水平见图1，表2。正常对照组、假手术组缺血半影区相对应区域的Ang-1mRNA呈中等水平表达，两组相对灰度值相近（P＞0.05）；模型组中，缺血半影区内Ang-1mRNA表达水平在脑缺血再灌注后各时间点均低于治疗组（P＜0.01），在脑缺血48 h，治疗组Ang-1mRNA表达水平达到峰值。

图1 RT-PCR检测Ang-1mRNA表达水平的电泳图

表2 各组大鼠缺血区脑组织Ang-1mRNA表达的比较（±s）

表2 各组大鼠缺血区脑组织Ang-1mRNA表达的比较（±s）

组别n 6 h 24 h 48 h 96 h正常对照组10假手术组10模型组10 0.88±0.03 0.88±0.03 0.88±0.03 0.88±0.03 0.87±0.05 0.87±0.05 0.87±0.05 0.87±0.05 0.60±0.03 0.86±0.04 1.23±0.16 0.89±0.05治疗组10 0.89±0.04 1.52±0.57**1.70±0.48**1.30±0.48**

3 讨论

血管生成是从已有血管发芽生成新血管的过程。这一过程与血管内皮细胞迁移和增殖相关，主要包括激活期血管基底膜降解，血管内皮细胞的激活、增殖、迁移，重建形成新的血管和血管网，是一个涉及多种细胞的多种分子的复杂过程。血管形成是促血管形成因子和抑制因子协调作用的复杂过程，正常情况下二者处于平衡状态，一旦此平衡打破就会激活血管系统，使血管生成过度或抑制血管系统使血管退化。Ang是一族分泌型的生长因子，该家族主要由Ang-1、Ang-2、Ang-3和Ang-4 4种因子组成。有研究发现其在血管内皮凋亡、血管形成后期的成熟、稳定性及重建方面扮演着非常重要的角色［6］。

头针，又称头皮针，是在头部特定的穴线进行针刺来防治疾病的一种方法，是脑源性疾病的常用针刺方法。《灵枢·大惑论》说“五脏六腑之精气，皆上注于目而为精……而与脉并为系，上属于脑，后出于项中”；《灵枢·邪气脏腑病形》中说“十二经脉，三百六十五络，其血气皆上走空窍”；《素问·脉要精微论》说“头者精明之

本研究表明，正常对照组、假手术组缺血半暗区Ang-1mRNA呈中等水平表达，两组相对灰度值相近；而治疗组各时间点均较模型组高，尤其是在脑缺血48 h，治疗组Ang-1mRNA表达水平达到峰值。由此推断，头针治疗可提高Ang-1的表达水平，促进与Tie-2的Fc段结合，使受体磷酸化被激活，诱导内皮细胞出芽，形成血管树样结构，并募集内皮周围支持细胞，促进血管重塑和成熟，形成完整的血管壁，并通过调节内皮细胞和间质细胞的相互作用维持血管管腔的完整性和稳定性。

综上所述，头针通过在一定范围内增加大鼠局灶性脑缺血再灌注后Ang-1的表达，从而促进缺血区血管新生，减轻脑缺血后的损失，达到治疗缺血性卒中的目的。参考文献

［1］Zhang ZG，Zhang L，Croll SD，et al.Angiopoietin-1 reduces cerebral blood vessel leakage and ischemic lesion volume after focal cerebralembolic ischemia inmice［J］.Neuroscience，2002，113（3）：683-687.

［2］Nagasawa H，Kogure K.Correlation between cerebral blood and histologic changes in a new ratmodel of cerebral artery occlusion［J］.Stroke，1989，20（8）：1037-1043.

［3］Zea Longa EL，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middlecerebralarteryocclusionwithoutcraniectomy in rats［J］. Stroke，1989，20（1）：84-91.

［4］华兴邦.大鼠穴位图谱的研制［J］.实验动物与动物实验，1991，3（1）：1-5.

［5］张晓明，董德河，丁玲.电针对局灶性脑缺血再灌注大鼠神经行为学障碍的影响［J］.河南中医，2012，32（5）：573-575.

［6］Ardelt AA，McCullough LD，Korach KS，etal.Estradiol regulates angiopoietin-1 mRNA expression through estrogen receptor-alpha in a rodent experimental stroke model［J］. Stroke，2005，36（2）：337-341.

［7］东贵荣，于致顺，石宪.头穴透刺治疗偏瘫的研究近况［J］.针灸学报，1992，9（1）：54-56.

［8］张红星，周利，张唐法.头针对大鼠急性局灶性脑缺血再灌注损伤的影响［J］.浙江中西医结合杂志，2006，16（5）：268-269.

［9］周利，张红星，张唐法.头针治疗卒中易感型自发性高血压大鼠的实验研究［J］.上海针灸杂志，2006，25（6）：42-44.

［10］吴广伟.针刺治疗缺血性脑中风30例疗效观察［J］.国际医药卫生导报，2006，12（22）：79-80.

Expressions of Angiogenin-1 m RNA after Scalp Acupuncture in Focal Cerebral Ischem ia in Rats Brain Tissues

YANGMin，CHEN Bang-guo，Liang Chao，et al.Hubei University of Chinese Medicine，Hubei，Wuhan

430065，China

Objective:To observe the scalp acupuncture in treatment of cerebral blood vessel generation reperusion of rats with focal cerebral ischemia in the expression changes of different time points and to explore the changing rules and analysis the action mechanism of Ang-1 after cerebral ischemia in cerebral arterial thrombois.Methods:Rats were randomly divided into the normal control group，the control group，the model group and he treatment group.The treatment group was divided into the ischemia reperfusion group at 6，24，48 and 96 h，with the improved wire plug do legal permanentmiddle cerebral artery occlusion（MCAO）model.And then，some ndicators were used RT-PCR to detect each group rats ischemic penumbra area Ang-1 mRNA expression level. Results:In the normal control group，control group of Ang-1 mRNA of the equivalent expression，compared with model group，Ang-1 mRNA of the scalp needle group rats group were increased at each time point.Compared with themodel group，the cerebral ischemia reperfusion 48 h thatwas the highest concentration of these levelswas higher significantly（P＜0.05 or 0.01）.Conclusion:That Ang-1 is imoportant after focal cerebral ischemia and other vascular specific growth factor in ischemic penumbra formation of new blood vessels and inhibit apoptosis of neurons is conducive to improve the ischemic penumbra area blood supply and promote nerve functional recovery.

Focal cerebral ischemia；Reperfusion；Angiopoietin-1；RT-polymerase chain reaction

R285.5

A

1004-745X（2014）01-0012-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.01.006

教育部高等学校博士学科点专项科研基金资助项目（200805070002）

2013-07-30）