联用检测仪器与显色培养基对食品和水产品中沙门氏菌的检验

刘新亮，潘仲乐，庞钧予，邢 丹，赵舒婷

（黑龙江出入境检验检疫局，哈尔滨 150001）

沙门氏菌是重要的肠道致病菌，在分类学上属于肠杆菌科沙门氏菌属，根据抗原成分的不同分成2 000多个血清型，目前我国已发现的血清型有216个[1]。沙门氏菌属于人畜共患病原菌，极易污染食品、水产品和水源，是引起食物中毒的常见致病菌，也是引起腹泻的重要病原菌之一[2]。目前沙门氏菌的检测方法主要有国标法、免疫磁珠法、乳胶凝集试验法、基因探针法和PCR法等[3]。国标法要经过增菌、分离培养、生化实验、血清学实验等，过程繁琐，操作复杂、耗时长；免疫磁珠法和乳胶凝集试验法可对大量样品进行筛选，但较易出现假阳性；基因探针法和PCR法投入较大，且不能区分死活细胞，假阳性的发生率很高。因此，传统方法在一定程度上很难满足对食品中沙门氏菌进行快速、准确检测的需要。随着生物技术的发展，出现了许多经过国际权威机构认可，有较高灵敏度和特异性的检测仪器和试剂。本文采用全自动荧光酶免疫分析仪（miniVIDAS）、全自动微生物鉴定仪（VITEK 2 Compact）和沙门氏菌显色培养基对食品和水产品中的沙门氏菌进行检测，并与传统方法进行比较，探索出快速检验方法在食品检验中应用的可行之路[4-5]。

1 材料与方法

1.1 检测样品来源

样本为黑龙江出入境检验检疫局同食品药品监督管理局共同无菌采集的豆制品、水产品200份以及黑龙江出入境检验检疫局工商管理局共同无菌采集的糕点、辣椒酱、饮料、巧克力、葡萄酒、饼干和速冻食品195份，共计395份，每份样本均采用无菌包装，质量＞250 g，及时送实验室进行检测。

1.2 仪器和试剂

全自动荧光酶免疫分析仪（miniVIDAS）、全自动微生物鉴定仪（VITEK 2 Compact）、电子比浊计、SX2肉汤、VIDASSLM沙门氏菌试剂条、VITEKGN测试卡、无菌盐水（0.45%NaCl）由法国生物梅里埃（Biomerieux）公司生产[6-7]。科马嘉沙门氏菌显色培养基购自郑州博赛生物技术有限公司。缓冲蛋白胨水、TTB增菌液、SC增菌液、BS琼脂、XLD琼脂、HE琼脂、三糖铁琼脂、尿素酶琼脂、营养琼脂、营养肉汤、赖氨酸脱羧酶试剂、赖氨酸脱羧酶对照试剂、氰化钾培养基、靛基质、甘露醇、山梨醇、ONPG、卫矛醇、水杨苷、丙二酸盐购自北京陆桥技术有限公司。沙门氏菌诊断血清（56种）购自成都生物制品厂。试验用参考菌株见表1。

表1 试验用参考菌株

1.3 试验方法

1.3.1 检测仪器与显色培养基联用法

按照mini VIDAS操作手册，取样品25 g加入缓冲蛋白胨水中进行前增菌，36℃培养8～18 h后取0.1mL加入10mL SX2肉汤中，于41.5℃培养22～26 h进行选择性增菌，以无菌操作取SX2肉汤1mL，100℃水浴15min。取0.5mL灭活的SX2肉汤加入VIDASSLM试剂条的样品孔中，根据VIDAS操作规程检验，得出结果。取VIDAS检验结果阳性者，选取相应未经加热的SX2肉汤接种沙门氏菌显色培养基，于36℃培养24 h。再挑取可疑菌落，按要求配置成浊度在0.5～0.62菌悬液，选择GN鉴定卡，设定好相应信息，放入VITEK 2 Compact仪器中，进行填充、封口、扫描等程序后进入孵育箱，培养4～7 h后自动进行判读[8]。

1.3.2 国标法

按照国家标准GB 4789.4－2010进行检测。

2 结果与分析

2.1 检测仪器与显色培养基联用法检测结果的可靠性验证

将标准菌株接种于25mL营养肉汤中，36℃培养24 h活化，制成浓度约1～2×108cfu·mL-1的菌悬液，然后将其接种至225mL缓冲蛋白胨水中，打乱顺序，标注编号，分别按照联用法和国标法进行分离鉴定[9]。联用法与国标法结果对比见表2。

从表2可以看出，联用法对不同标准菌株进行检测，可以准确地分离鉴定出其中的沙门氏菌菌株，对非沙门氏菌采用全自动荧光酶免疫分析仪（miniVIDAS）进行初筛，即可筛除。同时为验证本方法的可靠性，采用国标法对同编号样本进行分离鉴定，然后将所有样本用API20E、APISTAPH 25进行鉴定，所得结果与联用法完全一致。

2.2 检测仪器与显色培养基联用法与国标法同时检测食品和水产品中沙门氏菌的结果比较

分别采用检测仪器与显色培养基联用法和国标法对糕点、辣椒酱、饮料、巧克力、葡萄酒、饼干、速冻食品、豆制品和水产品进行检测，联用法与国标法结果对比见表3。

从表3可以看出，采用联用法对395份食品和水产品样本中沙门氏菌进行检测，其中通过mini VIDAS筛选出阳性菌52株，采用沙门氏菌显色培养基进行复筛后，剩余20株，用VITEK 2Compact进行鉴定后，证实其中18株为沙门氏菌，其余2株为弗氏柠檬酸杆菌和恶臭假单胞菌。而采用国标法检出阳性菌株18株，两种方法的最终结果完全一致。

采用miniVIDAS对395份食品和水产品样本进行检测，出现32例假阳性结果，采用显色培养基进行复筛和用VITEK 2 Compact进行鉴定后排除，所有样本没有出现假阴性结果。由此证明，单独采用VIDAS存在出现假阳性结果的可能，而结合显色培养基后可减少出现的假阳性结果，再用VITEK鉴定后既可不会出现假阳性结果，从而避免错检、漏检的情况。且通过试验确定显色培养基对VITEK 2 Compact的结果不存在影响[10]。林涛等研究只提到了用于水产品中国沙门氏菌的检测，并没有将此方法应用到食品中[11]。本试验在对大量食品基材进行对比后，得出与国标法相同的检测结果。故仪器联用显色培养基的方法可以同时应用到食品和水产品这两大类。

表2 联用法与国标法结果对比

表3 联用法与国标法结果对比

2.3 检测仪器与显色培养基联用法的问题

本试验所采用方法的培养时间，缓冲蛋白胨水前增菌时间为8～18 h，SX2肉汤的选择性增菌时间为22～26 h。方法允许的最快培养时间为30 h，但为防止漏检，应适当延长增菌时间。在使用显色培养基时，许多伤寒沙门氏菌可能在培养24～48 h才会出现紫色菌落。用VITEK鉴定沙门氏菌绝大部分只能鉴定到沙门氏菌属，还需增加血清学实验才能进一步分型[12]。只有鸡沙门菌血清型、甲型副伤寒沙门菌血清型、伤寒沙门菌才能鉴定到种。林秋云等应用全自动微生物分析系统进行病原菌鉴定时间平均为4～6 h，比传统方法鉴定时间缩短，并能自动打印鉴定结果报告，两种方法的鉴定符合率为100%，准确性、可靠性和自动化程度优于传统鉴定方法[13]。

3 结论

试验结果表明，与国标法相比，联用法具有明显的时间优势，对于阴性样品，miniVIDAS可在30～44 h出具检测结果，而国标法至少需要4 d；对于阳性样品，经mini VIDAS初筛后，再通过沙门氏显色培养基的复筛以及VITEK的鉴定，也可在约30 h出具检测结果，而国标法至少需要9 d。通过联用法，最快可在60 h出具检测结果。

联用检测仪器与显色培养基检测食品和水产品中的沙门氏菌，可以充分发挥两种检测手段的优越性：VIDAS具有灵敏度高，速度快，检测能力强，一般上机几十分钟即可得到初筛结果，可以作为大批量样品的筛查，有效地节约检验时间，减少工作量。由于单独采用VIDAS存在出现大量假阳性结果的可能，所以配合显色培养基使用后就可大幅减少假阳性结果，再配以VITEK进行鉴定，就能在保证检测结果准确可靠的前提下，大幅节省检测时间[14]。

[1]王秀茹.预防医学微生物学及检验技术[M].北京:人民卫生出版社,1996.

[2]潘雪霞,朱敏,梅玲玲,等.食品中沙门菌污染状况及耐药性研究[J].中国卫生检验杂志,2006,16（9）:1 103-1 104.

[3]张洁梅.食品微生物检验技术的研究进展[J].现代食品科技,2005,21（2）:221-222.

[4]寇运同,张明玉,韩青,等.荧光酶标分析系统快速检测食品中的沙门氏菌[J].中国动物检疫,2000,17（9）:39-40.

[5]王瑶,徐英春,谢秀丽,等.全自动微生物鉴定药敏分析仪对临床相关细菌药敏测定能力的评估[J].中华检验医学杂志,2007,30（9）:1 052-1 055.

[6]陶凤蓉,宣天芝,张秀珍.全自动荧光酶免疫分析仪检测沙眼衣原体临床应用评价[J].中华医学感染学杂志,2005,15（7）:835-836.

[7]杨毓环,陈伟伟.VITEK全自动微生物检测系统原理及其应用[J].海峡预防医学杂志,2000,6（3）:38-39.

[8]刘俊华,黄愈玲,李秀珍.全自动细菌分析仪系统在检测引起食物中毒病原菌的应用[J].中国卫生检验杂志,2002,12（5）:554-555.

[9]ZimbroM J,Power DAD,Manual BB L.Manualofmicrobiological culturemedia[M].Mary land:Becton,Dickson and Company,2003.

[10]李皇,张耀平,梁林慧.洋葱伯克霍尔德菌在几种肠道选择性培养基上的生长比较及对VITEK鉴定的影响[J].广西医科大学学报,2009（1）:98-100.

[11]林涛,兰敏,黄伟,等.荧光酶免疫分析仪-微生物鉴定仪在水产品沙门氏菌检测中的应用[J].食品与发酵工业,2008,34（8）:133-136.

[12]梁景涛,陈淑玲,余淑冰.微生物鉴定系统在食物中毒病原菌检测中的应用[J].华南预防医学,2004,30（8）:32-33.

[13]林秋云,尹映华.全自动微生物分析系统在微生物检验中的应用[J].中国热带医学,2006,6（8）:1 477-1 1 478,1 520.

[14]黎昊雁,王玮,施伟良,等.使用VITEK检测化妆品中的绿脓杆菌[J].中国卫生检验杂志,2005,15（1）:100-101.