NSCLC组织中nm-23和VEGF蛋白的表达及其临床意义

阳诺，马辉，冼磊，陈铭伍，郭建极，胡松

(广西医科大学第一附属医院心胸外科1、肝肠外科2，广西 南宁 530021)

·论著·

NSCLC组织中nm-23和VEGF蛋白的表达及其临床意义

阳诺1，马辉2，冼磊1，陈铭伍1，郭建极1，胡松1

(广西医科大学第一附属医院心胸外科1、肝肠外科2，广西 南宁 530021)

目的探讨非小细胞肺癌(NSCLC)组织中nm-23和VEGF蛋白的表达情况及其临床意义。方法通过免疫组化和组织芯片技术，分别检测208例NSCLC患者肿瘤组织、150例癌旁组织及17例良性疾病肺组织中nm-23和VEGF蛋白的表达状况。结果①NSCLC癌组织中nm-23蛋白的表达程度显著高于癌旁组织及良性肺疾病组织(P<0.001)；nm-23蛋白表达程度与NSCL的C临床分期、分化程度相关(P<0.05)。②NSCLC癌组织中VEGF蛋白表达程度显著高于癌旁组织及良性肺疾病组织(P<0.001)；VEGF蛋白表达程度与NSCLC分化程度、临床分期和淋巴结转移与否相关(P<0.05)。结论①NSCLC肿瘤组织中nm-23及VEGF蛋白均呈高表达，提示两者与NSCLC的发生发展密切相关；②NSCLC的临床分期及分化程度与nm-23蛋白表达程度相关，NSCLC的临床分期、分化程度及淋巴结转移与否与VEGF蛋白表达的程度相关，提示两者均与肿瘤恶性生物学行为密切相关。

组织芯片；免疫组化；nm-23；VEGF；非小细胞肺癌

nm-23是近年研究较多的肿瘤转移抑制基因之一，但关于nm-23蛋白的表达与非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)的关系尚不明确。此外，NSCLC的浸润性生长、转移及预后有赖于血管生长，但关于血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表达与NSCLC的关系同样尚不明确。本研究通过应用组织芯片、免疫组化技术，检测nm-23和VEGF蛋白在NSCLC中的表达情况，以期探讨其与NSCLC的关系。

1 资料与方法

1.1 标本来源采集我院2001年4月至2008年7月共208例NSCLC标本。所有患者术前无放、化疗，为初治，均行肺癌根治术，有病理诊断。其中，男性144例，女性64例；年龄35～84岁；腺癌126例，鳞癌69例，其他13例；中高分化124例，低分化84例；淋巴结转移79例，无淋巴结转移129例；临床分期Ⅰ、Ⅱ期129例，Ⅲ、Ⅳ期79例。150例NSCLC患者同期取癌旁组织检测。此外，选取17例经手术治疗的良性肺疾病患者为对照，其中男性11例，女性6例，年龄20～69岁。以上标本均以福尔马林固定，石蜡包埋，4 μm厚度连续切片经HE染色及SP法免疫组化染色，显微镜下明确诊断。

1.2 主要仪器、试剂nm-23及VEGF免疫组化试剂盒购自福建迈新生物技术公司。组织阵列仪由美国Beecher Instruments公司生产。去除DNA和RNA酶的载玻片产自德国Menzel Glaser公司，在多聚赖氨酸溶液中浸泡包被1 min，45℃烤箱内烘干，备用。

1.3 方法

1.3.1 制作组织芯片采用108点(12×9)的长方形阵列图，36例NSCLC组织每例取2点，36例癌旁组织每例取1点，合计108点，癌旁组织不足的用正常组织替代。选取HE切片标本中的肿瘤集中区域，在对应蜡块的相应位置做标记。按49:1的比例将德国莱卡蜡和美国进口蜡混合，经3次沉淀去除杂质，制成受体蜡块。在受体蜡块上按设计好的阵列图应用阵列仪打孔(直径、间距及深度均为2 mm)，从供体蜡块上提取选定的组织注入受体蜡块相应部位，重复该步骤直至108点均有组织芯。将芯片蜡块含组织面倒放于干净的载玻片上，37℃恒温箱放置15 min后取出，载玻片轻压蜡块，使含组织的一面保持平整；蜡块50℃过夜，使组织芯和受体蜡块进一步融合；自然恢复室温后，4℃过夜；然后3～4 μm切片，控制水温45℃左右捞片；将切片58℃过夜，用于后期实验。切片裱于玻片上，蜡封，4℃保存。

1.3.2 染色及判定结果SP法行免疫组化染色。一抗为nm-23免疫组化试剂盒及VEGF免疫组化试剂盒，良性肺疾病肺组织为对照。胞浆内出现棕黄色颗粒为阳性，依据阳性细胞所占百分比：阴性为<10%，阳性为>10%。

1.4 统计学方法应用SPSS13.0统计软件进行数据分析,其中两样本率的比较采用卡方检验，多样本率的比较采用秩和检验，以P＜0.05为差别有统计学意义。

2 结果

2.1 组织芯片蜡块本实验共制作6个组织芯片蜡块，效果良好。

2.2 NSCLC肿瘤组织、癌旁组织及良性肺疾病肺组织中nm-23、VEGF的蛋白表达情况nm-23蛋白在208例NSCLC肿瘤组织中呈阳性表达161例，150例癌旁组织中呈阳性表达11例，17例良性肺疾病肺组织中呈阳性表达1例。其中，nm-23蛋白在肿瘤组织与癌旁组织中的表达情况差异有统计学意义(χ2=69.246，P<0.05)；在肿瘤组织与良性肺疾病肺组织中的表达情况同样差异有统计学意义(χ2=10.224，P<0.05)；但在癌旁组织与良性肺疾病肺组织中的表达差异无统计学意义(χ2=0.000，P>0.05)。VEGF蛋白在208例NSCLC肿瘤组织中呈阳性表达113例，150例癌旁组织中呈阳性表达2例，17例良性肺疾病肺组织中呈阳性表达0例。其中VEGF蛋白在肿瘤组织与癌旁组织中的表达情况差异有统计学意义(χ2= 64.371，P<0.05)；在肿瘤组织与良性肺疾病肺组织中的表达情况同样差异有统计学意义(χ2=8.990，P< 0.05)；但在癌旁组织与良性肺疾病肺组织中的表达差异无统计学意义(χ2=0.000，P>0.05)。

2.3 nm-23、VEGF蛋白与NSCLC患者临床病理参数的关系nm-23的蛋白表达与NSCLC的临床分期及分化程度相关(P<0.05)，VEGF的蛋白表达与NSCLC的分化程度、临床分期及淋巴结是否转移相关(P<0.05)，见表1。

表1 nm-23与VEGF与非小细胞肺癌临床病理参数的关系[例(%)]

2.4 nm-23与VEGF的相关性nm-23与VEGF在NSCLC组织中两者均表达阳性93例，均表达阴性7例，nm-23表达阳性而VEGF表达阴性68例，VEGF表达阳性而nm-23表达阴性20例。经统计学关联性分析，χ2=2.565<3.84，P>0.05，提示两基因表达之间不存在相关性。

3 讨论

肿瘤的发生、发展及转移是多基因共同作用所致，且基因与蛋白产物之间相互作用、彼此调控，因此肿瘤中基因的异常表达及其与肿瘤发生、发展、淋巴结转移的相互关系是目前肿瘤分子生物学研究的热点问题。

nm-23基因是一个多功能基因，与细胞的生长、分裂、转录、翻译调控、分化抑制、信号传导、微管组装相关，同时与癌的发生、发展、转移等密切相关。不少研究证实在人或动物的某些实体癌中存在nm-23基因的表达，其表达水平与肿瘤转移呈负相关，因此认为nm-23基因是一种肿瘤转移抑制基因，但确切机制尚不清楚。目前，肺癌中关于nm-23基因在抑制肺癌转移方面的作用，结论各家报道不一，其中有不少研究认为nm-23基因与肿瘤分化程度以及淋巴结转移相关[1-2]，但也有研究认为nm-23基因的表达是独立的临床病理学因素,与患者的肿瘤分期、大小、分化程度、淋巴结受侵袭状态及预后均无明显关系。本研究表明，nm-23的蛋白表达与NSCLC患者的性别、年龄、病理类型和淋巴结是否转移无关，但与临床分期及分化程度有关，与国内一些研究结果相似[3-4]。这提示nm-23蛋白在肺癌的演进过程中可能起着重要的调节作用，其表达水平可作为判断肺癌预后的指标之一。

VEGF通过诱导内皮细胞表达血浆纤溶酶原激活剂(PA)及血浆纤溶酶原激活物的抑制剂(PAⅠ～Ⅱ)，促进细胞浸润，从而利于血管形成。肿瘤血管生成是肿瘤生长和转移的重要步骤，大量研究表明，若没有血管供应，肿瘤直径不会超过2 cm。目前己知多种细胞因子和生长因子参与了血管生成的调控，而VEGF可能是其中最关键的刺激因子[5]。在人体许多正常组织中VEGF呈低表达，但在大多数恶性肿瘤中却高表达[6]，且表达程度与肿瘤的分期和预后相关[7-8]，本研究得到相同的结论。此外，本研究结果显示VEGF的基因表达与NSCLC患者的性别、年龄、病理类型无关，但与其分化程度、临床分期及淋巴结是否转移有关，这与国内外的研究结果相一致[9-13]；同时，研究结果还提示VEGF蛋白的表达与淋巴管生成数量呈正比，与淋巴结转移呈显著正相关，提示VEGF可能与肿瘤的浸润转移有相关性。目前，已有针对VEGF的药物如重组人血管内皮抑素(商品名：恩度)、抗VEGF单克隆抗体贝伐单抗(商品名：Avastin)等，其主要的药理学机制就是通过减少VEGF与其相应的受体结合，从而抑制内皮细胞增殖和新生血管形成，达到抑制肿瘤的作用。

国内众多研究显示，nm-23、VEGF基因在肺癌中无相关性，它们通过各自不同的途径在肺癌的发生发展过程中发挥作用。本实验也证实在NSCLC中nm-23、VEGF蛋白表达无明显相关性，提示这两种蛋白在NSCLC的发生发展过程中可能是相对独立的事件。但我们的研究表明，nm-23、VEGF蛋白表达与非小细胞肺癌的细胞分化、临床分期等均有密切关系，提示我们可能可以通过检测nm-23、VEGF蛋白的表达作为评价NSCLC生物学行为及预后的参考指标之一。

[1]周清华,车国卫,覃扬,等.nm232H基因逆转肺癌转移表型及其分子机制的实验研究[J].中国肺癌杂志,2003,6(2):141-143.

[2]周清华,王艳萍,车国卫,等.人大细胞肺癌细胞NL9980和L9981的建立及其生物学特性研究[J].中国肺癌杂志,2003,6(6): 464-468.

[3]闫海军,陈明伟.nm23基因在人肺癌组织中的表达及其临床意义[J].东南大学学报,2009,28(4):281-284.

[4]王子彤,张海清,李世业.nm23-H1与CD44v6在非小细胞肺癌中的表达及临床意义[J].中国肺癌杂志,2002,5(4):278-281.

[5]Dankbar B,Padro T,Leo R,et al.Vascular endothelial growth factor and interleukin-6 in paracrine tumor-stromal cell interactions in multiple myeloma[J].Blood,2000,95(8):2630-2636.

[6]Koul D,Shen R,Garyali A,et al.MMAC/PTEN tumor suppressor gene regulates vascular endothelial growth factor mediated angiogenesis in prostate cancer[J].Oncol,2002,21(3):469-475.

[7]Yang SX,Hewitt SM,Steinberg SM,et al.Expression levels of eIF4E,VEGF,and cyclin Dl,and correlation of eIF4E with VEGF and cyclin D1 in multi-tumor tissuemicroarray[J].Oncol Rep, 2007,17(2):281-287.

[8]Yi J,Pan TC.Expression of vascular endothelial growth factor C and its receptor VEGF2R3 and their significance in non2small cell lung cancer[J].Chin J Lung Cancer,2004,7(6):488-492.

[9]吕传剑,万娅敏,陈学军,等.VEGF在周围型肺癌癌组织中的表达及意义[J].山东医药,2009,49(3):57-59.

[10]吴金如,刘颖.VEGF、p53在非小细胞肺癌中的表达及其相关性[J].中国误诊学杂志,2008,8(7):1523-1525.

[11]Roskoski RJ.Vascular endothelial growth factor(VEGF)signaling in tumor progression[J].Crit Rev Oncol Hematol,2007,62(3): 179-213.

[12]吕喜英,李青山,张秀琴.Survivin与VEGF在肺癌中的表达及意义[J]山东医药,2007,47(13):4-5

[13]Miyata Y,Kanda S,Ohba K,et al.Lymphangiogenesisand angiogenesis in bladder cancer：prognostic implications and regulation by vascularendothelial growth factors-A,-C,and-D[J].Clin Cancer Res,2006,12(3):800-806.

Expression and significance of nm-23 and VEGF protein in the patients with non-small cell lung cancer.YANG

Nuo1,MA Hui2,XIAN Lei1,CHEN Ming-wu1,GUO Jian-ji1,HU Song1.Department of Cardiothoracic Surgery1, Department of Enterohepatic Surgery2,the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University,Nanning 530021, Guangxi,CHINA

ObjectiveTo study the expression and significance of nm-23 and vascular endothelial growth factor(VEGF)protein in patients with non-small cell lung cancer(NSCLC).MethodsThe expression of nm-23 and VEGF protein was detected in tumor tissues of 208 patients with NSCLC,adjacent tissues of 150 patients and lung tissues of 17 patients with benign lung disease by tissue microarray and immunohistochemistry.Results①The expression of nm-23 protein was significantly higher in NSCLC tumor tissues than that in adjacent tissues and benign lung tissues(P<0.01).The difference of nm-23 protein expression between different clinical stages and differentiations was significant(P<0.05).②The expression of VEGF protein was significantly higher in NSCLC tumor tissues than that in adjacent tissues and benign lung tissues(P<0.01).The difference of VEGF protein expression with different differentiations,clinical stages and lymph node metastasis was significant(P<0.05).Conclusion①nm-23 and VEGF protein is highly expressed in NSCLC and associated with the development of NSCLC,so they can be used for early diagnosis of NSCLC;②nm-23 protein is associated with the clinical stage and differentiation,and VEGF protein is associated with the differentiation,clinical stage and lymph node metastasis.

Tissue microarray;Immunohistochemistry;nm-23;Vascular endothelial growth factor(VEGF); Non-small cell lung cancer

R734.2

A

1003—6350（2014）07—0941—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.07.0366

2013-09-04)

广西卫生厅科研立项课题(编号：桂卫Z2011329)；广西科学研究与技术开发计划项目(编号：桂科攻10124001A-44)；广西留学回国人员科学基金(编号：桂科回0832011)

冼磊。E-mail：xianlei59@163.com