中国南方地区不育男性Y染色体AZF区域微缺失分析

李 崎，周 繇，马 宁，卢伟英，徐 雯，马燕琳

（海南医学院附属医院海南省人类生殖与遗传重点实验室，海南 海口 570102）

中国南方地区不育男性Y染色体AZF区域微缺失分析

李 崎，周 繇，马 宁，卢伟英，徐 雯，马燕琳

（海南医学院附属医院海南省人类生殖与遗传重点实验室，海南 海口 570102）

目的 检测并分析中国南方地区不育男性Y染色体上无精症因子(Azoospermia factor，AZF)区域的微缺失情况。方法 运用多重PCR技术选用18个STS位点分为四组，设置空白对照，并采用正常男性DNA标本为阳性对照，筛查在海南医学院附属医院生殖医学中心就诊的1 152例诊断为无精、少精及弱精男性的AZFa、AZFb、AZFc和AZFd 4个区域的微缺失情况。结果 1 152例男性患者中共检出67例AZF微缺失，缺失率为5.8%；其中，无精症13例，弱精症1例，少精症7例，严重少精症46例。上述患者中60例被检出AZFc合并AZFd区或AZFb合并AZFd区的双重缺失，1例被检出AZFc、AZFb合并AZFd区的三重缺失；就各区缺失率而言，AZFa为1.49% (1/67)，AZFb为4.48%(3/67)，AZFc为92.54%(62/67)，AZFd为95.52%(64/67)。结论 采用多重PCR技术进行AZF微缺失检测十分简单可行，该项检测对了解男性不育发生原因、帮助临床制定辅助生殖技术方案十分必要。

多重PCR；无精症因子；微缺失

育龄夫妇发生不孕不育的概率为10%～20%，其中约50%由男性因素造成。生精障碍是男性不育的主要原因之一，其受很多因素的影响，如内分泌、营养不良、遗传因素或环境因素等。1976年，Tiepolo等[1]通过无精症患者染色体分析发现其Yq11区域内均存在大片段缺失，推测该区域可能存在与精子发生密切相关的基因或基因簇[1]，后续的相关研究陆续证明了这一观点。目前，人们将这些基因或者基因簇被称为无精症因子(Azoospermia factor，AZF)。AZF因子包含4个区域，分别为AZFa、AZFb、AZFc和AZFd区[2-4]。

研究发现，在Y染色体长臂区域包含了众多的回文结构和插入重复片段，人们推测这种结构是造成AZF区域易发生缺失的可能原因，目前已知，在AZF区域有近300个STS位点标记，这就为检测AZF区域的缺失提供了极大的便利[5-7]。笔者选用18个STS位点，采用多重PCR技术进行AZF区域的微缺失检测，以研究中国南方地区男性不育与AZF因子微缺失的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象 男性不育患者来自2004-2014年间2 062例来我院遗传咨询门诊、辅助生育门诊就诊的患者，经精液常规检测筛选出1 152例受检者。无精症及严重少精症按第四版WHO精液常规分析标准确定，连续3次精液检查分析并经离心沉淀均无精子者诊断为无精症，精子密度＜5.0×106/ml者为严重少精症，a+b＜50%或a＜25%为弱精症。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 抽取受试者外周血3 ml，EDTA抗凝，用红细胞裂解液裂解红细胞，分离得到的白细胞用蛋白酶K消化，然后采用笨酚-氯仿法抽提，酒精沉淀提取基因组DNA，-20°C冷冻保存备用。

1.2.2 多重PCR检测 选用Y染色体上坐落于AZF区内的18个STS位点，分别是AZFa区的SY81、SY182、SY86，AZFb区的SY121、SY124、SY127、SY128、SY130、SY133、SY134，AZFd区的SY145、SY152、SY153，AZFc区的SY242、SY239、SY254、SY255、SY157。设立SRY为内参对照，并同时设立正常男性阳性对照及空白对照，分成四组进行多重PCR扩增(见表1、表2)。各组的反应体系为25µl：含10X缓冲液2.5 μl、dNTPs 0.8 mmol/L、MgCl 21.5 mmol/L、模板100 ng、Taq DNA聚合酶0.5 mmol，引物各10 μmol/L，PCR循环条件设置如下：94°C预变性4 min，30个循环(95°C 30 s、58°C 30 s、72°C 60 s)，72°C延伸7 min，4°C保存。PCR产物用1%琼脂糖胶电泳120，45 min。EB染色，观察结果。

表1 引物序列

表2 引物分组

1.2.3 结果判定 若检测标本中阳性对照及所有位点具有扩增条带，且阴性对照及空白对照未见扩增条带，则判断为无缺失(见图1)；若待检标本阴性对照及空白对照未见扩增条带，SRY内参出现相应条带，而在多重PCR及单独扩增时未出现相应条带，则判断该位点缺失。

图1 三对正常父子的18个STS位点电泳图

2 结果

经临床及常规精液检测，在2 026例男性中发现1 152例有精液异常，其中无精症391例(不明原因)，梗阻性无精症7例，少弱精症690例，死精症6例、单纯少精精症58例。根据精液检查结果将患者细分为8组，分别命名为A、OA、OⅠ、OⅡ、OⅢ、OⅣ、OⅤ、OⅥ(见表3)。对这1 152例患者进行多重PCR扩增后电泳结果显示，67例被检出Y染色体AZF区微缺失，总缺失率为5.8%，4个区的缺失发生率从高到低的排列依次为AZFd(95.52%，64/67)、AZFc(92.54%，62/67)、AZFb (4.48%，3/67)、AZFa(1.49%，1/67)。缺失区域的组合类型分别为AZFa、AZFb、AZFc、AZFd、AZFbd、AZFcd和AZFcbd(见表4)，且AZFcd出现频率最高，缺失发生频率最高的STS位点为SY239(91.04%)(见表5)。

将精液检测结果与AZF缺失检测结果结合起来分析发现，AZFa区的缺失仅出现在无精症患者中，AZFb区的缺失分别出现在无精症和少弱精症患者中，检出频率分别为8.3%(1/12，A组)和5.5%(3/54，含OⅠ、OⅡ和OⅢ组)；AZFc区缺失分别出现在无精症和少弱精症患者中，检出频率分别为92.3%(12/ 13，A、OA组)和92.5%(50/54，含OⅠ、OⅡ和OⅢ组)；AZFd区缺失分别出现在无精症和少弱精症患者中，检出频率分别为84.6%(11/13，A、OA组)和96.2% (52/54，含OI、OⅡ和OⅢ组)。

表3 患者依据精液检测结果分组

表4 各组突变类型统计

表5 STS位点缺失率统计

3 讨论

AZF区域位于Y染色体长臂上，这个区域发生的缺失是男性不育发生的已知重要遗传因素。采用PCR-STS位点检测微缺失已经成为临床男性不育检测的常规内容[8]。

大多数研究者认为AZF包含AZFa、AZFb、AZFc区，也有学者认为在AZFc和AZFb区之间还有一个AZFd区，这个区域与AZFc和AZFb区在序列上存在交叠。由于每个区域包含的生精相关基因的不同，不同区域的缺失会有不同的临床表现。研究发现，AZFa区的缺失会影响精原干细胞和Sertoli细胞在精曲小管的生成与分布，该区域的缺失与无精症密切相关；AZFb区的缺失会影响精原干细胞在细胞减数分裂期的发展，AZFc区的缺失会影响精原细胞向精子细胞转化，会造成精子生成不足；AZFd区由于序列与AZFb和AZFc存在交叠，该区的缺失表现与AZFb和AZFc区的缺失表型相似[9-11]。

在本研究中，基于精液的常规检测结果将患者分为了8个组，并在其中的5个组检测出AZF区缺失。在1 152例男性不育的患者中，AZF区缺失检出率为5.8%，其中，391名A组中检出了12例缺失患者，缺失检出率为3.1%；在7例梗阻性无精症患者中，发现了1例患者携带AZF的缺失，提示梗阻性无精症患者同样也存在携带基因缺陷的可能；在少精症(OⅠ和OⅡ组)和严重少精症(OⅢ组)患者中的缺失检出率分别为2.4%和13.1%，值得注意的是，在OⅠ、OⅡ、OⅢ组患者并非单纯的少精，同时还表现出不同程度的精子活力减退，而在OⅤ和OⅥ组中，并未检出AZF区的缺失，精液常规检测表明，这两个组的精子活力正常，相关结果提示，AZF区域的基因不仅与精子的发生相关，还可能影响精子的活动力。

本研究还发现，在缺失区域AZFd区的缺失发生率最高，为95.52%，然后依次为AZFc(92.54%)、AZFb(4.48%)和AZFa(1.49%)；STS位点缺失检出率最高的为SY239(91.04%)，然后依次为SY254 (89.55%)、SY255(89.55%)、SY242(88.06%)、SY242 (88.06%)、SY153(88.06%)，这些位点全部都分布在AZFc和AZFd区，通过序列比对得知，这些位点在Y染色体上都有多个拷贝，拷贝数从2～7不等(表5)，这也许就是缺失率高发的原因之一。

Y染色体微缺失的检测帮助我们在一个新的层面上了解了男性不育的发病原因，并开始帮助临床治疗。目前越来越多的人已经认识到AZF微缺失给人们的生育带来的困扰，并开始寻求相应的技术手段帮助这一类患者解决生育方面的问题，提供相关咨询，我们有理由相信AZF微缺失检测将会为越来越多的人提供帮助。

[1]Tiepolo L,Zuffardi O.Localization of factors controlling spermatogenesis in the nonfluorescent portion of the human Y chromosome long arm[J].Hum Genet,1976，34(2):119-124.

[2]Sawai H,Komori S,Koyama K.Molecular analysis of the Y chromosome AZFc region in Japanese infertile males with spermatogenic defects[J].J Reprod Immunol,2002,53(1-2):37-44.

[3]Sheikhha MH,Zaimy MA,Soleimanian S,et al.Multiplex PCR Screening of Y-chromosome microdeletions in azoospermic ICSI candidate men[J].Iran J Reprod Med,2013,11(4):335-338.

[4]Suganthi R,Vijesh VV,Vandana N,et al.Y Choromosomal microdeletion screening in the workup of male infertility and its current status in India[J].Int J Fertil Steril,2014,7(4):253-266.

[5]Mittal RD,Singh G,Srivastava A,et al.Y chromosome micro-deletions in idiopathic infertility from Northern India[J].Ann Genet, 2004,47(4):331-337.

[6]Feng C,Wang LQ,Dong MY,et al.Assisted reproductive technology may increase clinical mutation detection in male offspring[J]. Fertil Steril,2008,90(1):92-96.

[7]Vogt PH.AZF deletions and Y chromosomal haplogroups:history and update based on sequence[J].Human Reproduction Update, 2005,11(4):319-336.

[8]Imken L,El Houate B,Chafik A,et al.AZF microdeletions and partial deletions of AZFc region on the Y chromosome in Moroccan men[J].Asian JAndrol,2007;9(5):674-678.

[9]Choi JM,Chung P,Veeck L,et al.AZF microdeletions of the Y chromosome and in vitro fertilization outcome[J].Fertil Steril, 2004,81(2):337-341.

[10]Daniel M,Campagne Nt.Can male fertility be improved prior to assisted reproduction through the control of uncommonly considered factors?[J].Int J Fertil Steril,2013,6(4):214-223.

[11]Oates RD,Silber S,Brown LG,et al.Clinical characterization of 42 oligospermic or azoospermic men with microdeletion of the AZFc region of the Y chromosome,and of 18 children conceived via ICSI [J].Hum Reprod,2002,17(11):2813-2824.

Y chromosome AZF region microdeletions in infertile males in south China.

LI Qi,ZHOU Yao,MA Ning,LU Wei-ying,XU Wen,MA Yan-lin.Hainan Provincial Key Laboratory for Human Reproductive Medicine and Genetic Research,the Affiliated Hospital of Hainan Medical University,Haikou 570102,Hainan,CHINA

Objective To detect and analyze the microdeletions of Y chromosome Azoospermia factor (AZF)region in infertile males in South China.Methods A total of 1 152 infertile males with azoospermia and oligozoospermia from Reproductive Medicine Center of the Affiliated Hospital of Hainan Medical University were enrolled and tested for microdeletions of AZFa,AZFb,AZFc and AZFd regions in Y chromosome.Eighteen sets of STS primers were selected and divided to four groups for multiplex polymerase chain reaction(PCR)to determine Y-chromosome microdeletions.Blank controls and positive controls(healthy male's DNA)were included in every PCR experiment. Results Among the 1 152 patients,67(5.8%)were found at least one microdeletion in AZF regions,including 13 cases of azoospermia,1 case of asthenozoospermia,7 cases of oligozoospermia and 46 cases of severe oligozoospermia. Sixty patients had deletions in twoAZF regions:AZFc combined withAZFd orAZFb combined withAZFd.One patient had deletions in three AZF regions:AZFc combined with AZFb and AZFd.The rates of deletions were 1.49%(1/67)for AZFa,4.48%(3/67)for AZFb,92.54%(62/67)for AZFc,and 95.52%(64/67)for AZFd.Conclusion Multiplex PCR is a fast,simple and convenient way to analyze Y chromosome microdeletions,which could help us to understand the real cause of male infertility and provide advice for choosingART strategy.

Multiplex PCR;Azoospermia factor;Microdeletion

R698+.2

A

1003—6350（2014）18—2656—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.18.1044

2014-08-13)