热毒宁对呼吸道合胞病毒感染哮喘模型小鼠的影响*

卢协勤，杜强，高天明，张扬，翁晓琴，冯旰珠**

南京医科大学第二附属医院1药剂科；2呼吸科，江苏南京 210011

热毒宁对呼吸道合胞病毒感染哮喘模型小鼠的影响*

卢协勤1，杜强2，高天明2，张扬2，翁晓琴2，冯旰珠2**

南京医科大学第二附属医院1药剂科；2呼吸科，江苏南京 210011

目的：探讨热毒宁（RDN）对呼吸道合胞病毒（RSV）感染哮喘加重小鼠气道炎症的影响。方法：雌性BALB/c小鼠32只，随机分成4组，分别为对照组、鸡卵白蛋白（OVA）组、OVA/ RSV组、OVA/RSV/RDN组。无创肺功能检测各组小鼠气道反应性；HE染色观察肺部炎症变化；小鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）中炎性细胞计数并分类；ELISA法检测BALF中IL-4、IL-5、IL-13、IFN-γ含量。结果：RSV感染能够加重哮喘小鼠气道炎症与气道高反应性，RDN抑制RSV感染哮喘加重小鼠气道高反应性（P＜0.05）；RDN显著减少RSV感染哮喘小鼠BALF中IL-4、IL-5、IL-13、IFN-γ含量。结论：RDN可以减轻RSV感染的小鼠气道炎症反应，抑制气道高反应性。

呼吸道合胞病毒；哮喘；气道炎症；热毒宁

支气管哮喘是一种慢性气道炎症性疾病，气道炎症由多种炎性细胞，如嗜酸粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞、平滑肌细胞等参与所致。呼吸道合胞病毒（RSV）感染是导致哮喘急性发作的重要因素之一，RSV感染导致哮喘气道炎症加重，患者激素不敏感[1]。热毒宁注射液由青蒿、金银花、栀子3味中药提取精制而成，是一种抗菌抗炎的中成药，具有清热、疏风、解毒等功效。本研究应用热毒宁（RDN）干预RSV感染哮喘小鼠模型后，观察其对气道炎症和高反应性的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

6～8周龄的雌性SPF级BALB/c纯系小鼠〔上海斯莱克实验动物中心，生产许可SCXK（沪）2012-0002〕共36只，投放南京医科大学动物中心饲养（设置环境温度为25℃，湿度为70%）。使用专用于测定小动物的肺功能分析系统AniRes2005分析软件（北京贝兰博科技有限公司）；鸡血清卵蛋白（OVA，Ⅴ级，美国Sigma公司）；RSV A亚型原型株Long株由江苏省人民医院呼吸科赠予[2]；IL-4和干扰素-γ（IFN-γ）的酶联免疫吸附试验（ELISA）检测试剂盒购自北京达科为生物技术有限公司；IL-5、IL-13的ELISA检测试剂盒购自美国ADL公司。

1.2 方法

1.2.1 哮喘模型小鼠的制备和分组随机将32只小鼠分为4组，即正常对照组、OVA组、OVA/RSV组和OVA/RSV/RDN组，每组8只。

动物模型制作和分组：（1）OVA组：腹腔注入0．2 mL致敏溶液（包括OVA 100 μg，氢氧化铝凝胶1 mg），第21天起小鼠雾化吸入1%OVA激发，每次30 min，每天1次，连续5天。（2）OVA/RSV组：致敏、激发同OVA组，第21天鼻腔滴入滴度为1．0× 106空斑形成单位（PFU）的RSV 50 mL。（3）OVA/ RSV/RDN组：致敏、激发、病毒接种同前组，第21天起接种RSV后腹腔注射RDN 0．2 mL（江苏康缘药业股份有限公司生产，批号：140227），每天1次，连续5天。（4）正常对照组：以PBS代替OVA致敏、激发和RSV鼻腔滴入。

1.2.2 小鼠气道反应性激发实验OVA末次激发小鼠24 h后，用3%戊巴比妥钠（70 mg·kg-1）腹腔注射麻醉，行气管切开、气管插管，同时行尾静脉穿刺置管，将小鼠放入密闭的体描箱中，连接小型动物呼吸机行辅助通气，动物呼吸机参数设置为：呼吸频率90次/min，吸呼比为1．0∶1．5，潮气量为6 mL·kg-1。每只小鼠分别给予逐渐增加的氯化乙酰胆碱（ACH），浓度为0、10、30、90、270μg·kg-1，采用AniRes 2005动物肺功能分析系统测定气道阻力[3-4]。

1.2.3 小鼠血清和支气管肺泡灌洗液（BALF）细胞检测支气管肺泡灌洗（BAL）4组小鼠，眼眶静脉采血后行支气管肺泡灌洗，分3次缓慢注入生理盐水，每次注入量为0．4 mL，每次灌洗后立即回收置于离心管中，计量。BAL离心（1000 g，10 min）后细胞沉渣做瑞士染色并分类，上清液-70℃备用，行IFN-γ、IL-4、IL-5和IL-13检测。参照ELISA检测试剂盒使用说明书检测BALF中细胞因子和血清总IgE水平的含量。

1.2.4 小鼠肺组织病理改变取小鼠的左上叶肺组织，使用10%中性福尔马林液固定，石腊包埋、脱水、切片后进行HE染色。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 各组小鼠气道反应性的比较

经不同浓度的ACH激发以后，各组小鼠气道阻力变化见图1。在ACH浓度为10、30 μg·kg-1时各组小鼠气道阻力无显著性差异（P＞0．05）。当ACH的浓度分别为90和270 μg·kg-1时，OVA/RSV组较OVA组和正常对照组相比较，小鼠的气道阻力明显增加；OVA/RSV/RDN组与OVA/RSV组相比较，小鼠的气道阻力明显降低，差异有统计学意义（P＜0．05）。

图1 各组小鼠气道反应性的比较（±s，n=8）

2.2 各组小鼠BALF中炎性细胞计数

与正常对照组相比，OVA组和OVA/RSV组BALF总细胞数明显升高，其中OVA/RSV组升高明显，主要为嗜酸性粒细胞和中性粒细胞，与OVA组有统计学意义（P＞0．05）；OVA/RSV组经热毒宁（RDN）治疗后BALF中细胞总数以及嗜酸性粒细胞和中性粒细胞显著下降，与OVA/RSV组相比有统计学意义（P＜0．05）。见图2。

图2 小鼠BALF总细胞数及细胞分类（±s，n=8）

2.3 HE染色光镜观察

正常对照组小鼠支气管管腔以及血管周围未见明显的炎性细胞的浸润。OVA组和OVA/RSV组小鼠支气管管腔周围及黏膜下可见大量炎性细胞的浸润，肺泡腔内可见炎性渗出，其中OVA/RSV组较OVA组更加明显。而OVA/RSV/RDN组较OVA/ RSV组明显减轻。见图3。

图3 各组小鼠病理结果的比较（HE染色）

2.4 各组小鼠BALF和血浆中细胞因子水平的比较

见表1。

3 讨论

流行病学研究表明，呼吸道病毒感染是哮喘急性加重、致死的重要原因之一，因重度哮喘死亡患者的肺标本常检测到呼吸道合胞病毒[5-6]。由于已经感染过RSV的成人可以再次被同株的RSV感染，且缺乏有效的治疗手段，因此在哮喘的发病过程中针对RSV的抗感染研究具有重要意义。

表1 各组小鼠BALF中IFN-γ、IL-4、IL-5和IL-13水平比较（±s，n=6）

表1 各组小鼠BALF中IFN-γ、IL-4、IL-5和IL-13水平比较（±s，n=6）

*与正常组相比有统计学意义（P＜0.05）#与OVA/RSV组比较有统计学意义（P＜0.05）

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热毒宁是临床上常用的一种兼具抗菌、抗病毒作用的中成药，具有抗感冒、退热等作用，其临床疗效表明还具有抗炎、抑制机体非特异性炎症、提高机体抗氧化的能力。国内学者利用热毒宁治疗哮喘模型，发现其能够抑制哮喘模型的气道炎症[7]。在本研究中发现，与OVA组比较，OVA/RSV组小鼠气道炎症、气道阻力（RL）明显增加，提示哮喘经RSV感染可显著增加气道炎症与气道高反应性，炎性细胞计数及分类表明中性粒细胞和嗜酸性粒细胞明显增多；BALF中Th2细胞因子IL-4、IL-5和IL-13明显升高，同时发现Th1细胞因子IFN-γ也显著升高。使用热毒宁治疗后发现，RSV感染诱导加重的气道炎症与气道高反应性得到明显的减轻，提示热毒宁对于哮喘感染RSV具有较好的治疗价值。

总之，本研究结果提示热毒宁能够显著抑制RSV诱导的哮喘小鼠模型的气道炎症、降低气道高反应性。具体的机制有待今后的实验进一步阐明。

[1] Bera MM,Lu B,Martin TR,et al.Th17 cytokines are critical for respiratory syncytial virus-associated airway hyperreponsivenessthroughregulationbycomplement C3a and tachykinins[J].J Immunol,2011,187(8): 4245-55.

[2] Jiang XB,Huang M,Cui XF,et al.Respiratory syncytial virus infection differentiates airway dysfunction in the central and peripheral airways in OVA-sensitized mice[J].Exp Lung Res,2012,38(9-10):453-62.

[3] Zha WJ,Qian Y,Shen Y,et al.Galangin Abrogates Ovalbumin-Induced Airway Inflammation via Negative Regulation of NF-κB[J].Evid Based Complement Alternat Med,2013,2013:767689.

[4] Du Q,Gu X,Cai J,et al.Chrysin attenuates allergic airwayinflammationbymodulatingthetranscription factors T-bet and GATA-3 in mice[J].Mol Med Rep, 2012,6(1):100-4.

[5] Teichtahl H,Buckmaster N,Pertnikovs E.The incidence of respiratory tract infection in adults requiring hospitalization for asthma[J].Chest,1997,112(3):591-6.

[6] O'Sullivan S,Cormican L,Faul JL,et al.Activated cytotoxic CD8+T lymphocytes contribute to the pathology of asthm a death[J].Am J Respir Crit Care Med, 2001,164(4):560-5.

[7] 范广民，叶斌，李绍波，等.热毒宁注射液对哮喘大鼠肺组织病理改变及TRAF2表达的调控作用[J].浙江中西医结合杂志，2012，22（1）：3-5.

Effect of Reduning on Respiratory Syncytial Viruses Induced Airway Inflammation and Asthma Exacerbation in Mice*

LU Xie-qin1,DU QIANG2,GAO Tian-ming2,ZHANG Yang2,WENG Xiao-qin2,FENG Gan-zhu2**1Department of Pharmacy;2Department of Respiration,the Second Affiliated Hospital of Nanjing Medical U-niversity,Nanjing Jiangsu 210011,China

Objective：To evaluate the effect of Reduning(RDN)on respiratory syncytial virus(RSV)-induced airway inflammation and asthma exacerbation in Balb/c mice.Methods：Thirty-two female mice were randomly divided into 4 groups(n=8 for each group):control group,OVA(ovalbumin)group,OVA/ RSV group and OVA/RSV/RDN group.Airway responsiveness was assessed using a whole body plethysmography.Lung histopathological changes were evaluated by HE stain.Cells in bronchoalveolar lavage fluid (BALF)were counted and classified,the supernatants of the BALF were used for detection of interleukin (IL)-4,IL-5,IL-13 and interferon(IFN)-γ.Results：RSV infection induced airway inflammation and airway hyper-responsiveness(AHR)exacerbation.Administration of RDN remarkably inhibited airway inflammation and AHR.IFN-γ,IL-4,IL-5 and IL-13 levels in BALF decreased in OVA/RSV/RDN group compared with OVA/RSV group(P<0.01,respectively).Conclusion：RDN might suppress airway inflammation and AHR in RSV infected asthmatic mice.

Respiratory syncytial viruses;Asthma;Airway inflammation;Reduning

R965.1

A

1673-7806（2014）06-499-03

江苏省卫生厅医学科技发展基金临床药学科研课题（奥赛康基金课题）（P200960）；江苏省中医药管理局科研项目（LZ13228）；南京市卫生局科研项目（YKK13176）

卢协勤，男，副主任药师 E-mail:luxieqin@sohu.com

* *通讯作者 冯旰珠，男，主任医师 E-mail:zhu1635253@163.com

2014-07-30

2014-10-01