30nm染色质纤维高级结构的研究进展

董立平 陈萍 李国红

①博士研究生，②副研究员，③研究员，中国科学院生物物理研究所生物大分子国家重点实验室，北京 100101

30nm染色质纤维高级结构的研究进展

董立平①陈萍②李国红③

①博士研究生，②副研究员，③研究员，中国科学院生物物理研究所生物大分子国家重点实验室，北京 100101

30nm染色质纤维；螺线管模型；Z字结构模型；左手双螺旋；冷冻电镜技术；核小体；组蛋白H 1

真核生物的遗传物质DNA以染色质形式通过逐级折叠压缩存在于细胞核中。DNA缠绕组蛋白八聚体形成核小体，相邻的核小体由连接DNA串联起来形成染色质的一级结构：核小体串珠结构(beads-on-a-string)。一级结构进一步折叠形成30 nm染色质纤维。近30多年来，30 nm染色质纤维高级结构的解析一直是困扰分子生物学家们的一大难题。研究者利用电镜和X射线晶体学等生物物理学方法对30 nm染色质纤维结构进行研究，提出30 nm结构的两大模型：螺线管(so leno id)模型和Z字结构(zig-zag)模型。笔者综述了30 nm染色质纤维结构解析方面的研究进展，并着重阐述最近利用冷冻电镜方法解析的30 nm染色质结构，即以四个核小体为结构单元的左手双螺旋结构模型，最后对30 nm染色质纤维在体内是否存在，以及它在表观遗传调控中可能发挥的重要作用等问题进行了讨论和展望。

1953年4月25日，《Nature》杂志刊登了由Watson和Crick提出的DNA双螺旋结构模型[1]，这一研究成果可以跟达尔文的进化论相媲美，是生物学界的一次重要革命。61年后的同一天，2014年4月25日，《Science》杂志以长篇研究论文的形式发表了中国科学家在30 nm染色质纤维高级结构方面的成果，揭示30 nm染色质纤维高级结构是以四个核小体为结构单元的左手双螺旋结构[2]。

那么，什么是30 nm染色质纤维呢？1882年，德国细胞学家Flemm ing在研究细胞分裂时，发现细胞核中有易被碱性染料染色的物质，将其命名为染色质。之后德国解剖学家Waldeyer在1888年将染色质命名为染色体。在细胞分裂间期，电镜观察发现核内的染色质是一种细微纤丝，当细胞进入有丝分裂时，则形成高度浓缩的染色体。因此，染色质和染色体是同一物质在细胞不同时期的不同状态。

一种生物细胞核中全部染色体上遗传物质的总和称为基因组(genom e)。人的基因组含有大概30亿个碱基对(bp)，将这些碱基对串联成一条DNA绳子，其长度大概是2 m。这样长的DNA要想存在于几个微米大小的细胞核中就需要染色质的逐级折叠和压缩。在现代生物学的教科书中，对于这个过程的描述通常是分如下四步完成的，分别对应着染色质的四级结构：第一级结构是11 nm核小体串珠结构，它是DNA双螺旋“绳子”缠绕在组蛋白上形成的，相邻核小体之间由连接DNA相连；第二级结构是核小体串珠在连接组蛋白H 1的存在下，缠绕形成螺线管状的粗丝，即螺线管，每一螺旋包含6个核小体，其压缩比为6；第三级结构是由螺线管再进一步螺旋化成为直径为400 nm的超螺旋体，由30 nm螺线管缠绕形成，压缩比为40；第四级结构就是可以在显微镜下看到的染色体，它是由超螺旋体进一步压缩5倍形成的。通过以上四步，DNA的长度被凝缩了8400倍左右[3]。这是目前生物学界对于染色质结构的基本认识，也是分子生物学领域的经典理论。

1953年DNA双螺旋结构的解析，掀起了一场分子生物学领域的革命，而作为遗传物质载体的染色质，它的结构是如何组成的呢？越来越多的科学家对此产生浓厚的兴趣，并开展了大量的研究。Kornberg[4-5]首先在理论上取得了重大突破。1974年，他第一次提出核小体的概念，并且通过生化实验证明核小体是由DNA缠绕组蛋白八聚体形成的，是染色质的重复结构单元。同一年，Olins夫妇[6]在电镜下观察到了大鼠胸腺的染色质串珠结构(bead-like structure)。1975年，Cham bon及其合作者[7]同样在电镜下观察到了鸡肝的染色质串珠结构，一个一个的珠子即为核小体。这些发现都证明了核小体作为染色质基本单元的存在。之后，对于核小体精确三维结构组成的研究成为一大热点，并且在20世纪90年代取得了重大突破。1991年，M oudrianak is和其合作者[8]利用X射线晶体学的方法解析了分辨率为3.1Å的核小体的晶体结构，但是由于分辨率有限，研究者只是对DNA在组蛋白上缠绕的走向作出了一些推测，并没有给出确证的结论。直到1997年，Richmond等[9]将单个核小体的晶体结构分辨率提高到2.8 Å，并且在晶体结构中观察到核小体是由146个碱基对长度的DNA以左手螺旋的方式缠绕组蛋白八聚体所形成，从而对于染色质基本单位——核小体的精确结构组成，做出了完美的解释。众所周知，在人体细胞中，核小体会进一步折叠组装成直径为30 nm的染色质二级结构。那么染色质二级结构是以怎样的形式存在呢？这就使得30 nm染色质纤维精细结构的解析成为研究重点。但是这样一个既包含DNA，又含有蛋白质的超大复合物，其结构解析的难度可想而知。这个问题困扰了科学家们30多年，至今仍是分子生物学领域难以攻克的难题之一。

1 两种模型，各存争议

30多年来，大量的科学家被30 nm染色质纤维结构的研究所吸引，并投身其中。科学家们利用各种的生物化学和生物物理学技术，如电子显微镜、小角度X射线散射、中子散射、圆二色谱等，来研究30 nm染色质纤维的结构，并取得了一定的进展。30 nm染色质纤维的早期研究集中在体内分离纯化的天然染色质上。根据电镜及各种生物物理技术研究结果提出了几种关于30 nm染色质纤维的结构模型，主要归纳为两大类(图1)：螺线管结构模型[10]和Z字结构模型[11]。

早在1986年，Langmore等[12]就提出了染色质纤维的左手双螺旋结构模型，而且双螺旋的直径以及单位长度的量与连接DNA的长度相关。2004年，作为Z字结构模型的代表人物，Richmond及其合作者[13]利用电镜观察到了30 nm染色质纤维采用梯形(ladder)的Z字构象。之后，他们利用X射线晶体学方法研究四聚核小体的结构，得到分辨率大约为9 Å的四聚核小体晶体结构，在此基础上构建了30 nm染色质纤维的结构模型，支持Z字结构模型[14]。但是，需要指出的是，他们的30 nm染色质纤维是在高浓度的镁离子和化学交联条件下观察到的，并且没有加入连接组蛋白H1，并不接近体内天然条件，很难反映30 nm染色质纤维的真实结构。另一派螺线管结构模型的代表人物是剑桥大学的Rhodes及其合作者。他们利用类似的盐透析方法和601 DNA序列，在加入H1条件下体外组装30 nm染色质纤维。他们的电镜及冷冻电镜结果显示30 nm染色质纤维并非梯形的Z字构象，而是一种更加紧密的交叉螺线管(interdigitated solenoid)结构[15]。他们进一步研究发现核小体间连接DNA的长度可能会影响30 nm染色质纤维的结构[16]。

自1976年30 nm染色质纤维的螺线管结构模型被提出至今已经30多年[17]，无数科学家曾试图揭示其中的奥秘。核小体是如何排列组装形成30 nm染色质纤维？这是一个亟待解决的问题，而解决争议的唯一方法，就是得到高分辨率的结构模型。

图1 30 nm染色质纤维的螺线管结构模型(a)和Z字结构模型(b)[15]

2 30nm染色质高级结构解析

2.1 冷冻电镜技术是一把利器

最近几年结构生物学蓬勃发展，X射线晶体学、核磁共振方法(NMR)以及冷冻电镜技术已经发展为成熟的结构生物学研究手段。X射线晶体学是研究晶体中原子排列的学科，利用电子对X射线的散射作用获得晶体中电子密度的分布情况，再从中分析获得原子的位置资讯，即晶体结构。核磁共振方法则是利用具有磁距的原子核在高强度磁场作用下，可吸收共振频率的电磁辐射由低能态向高能态跃迁的现象对分子的结构信息进行研究。不同分子中原子核的化学环境不同，导致不同的共振频率，从而产生不同的核磁共振谱。在结构生物学领域，X射线晶体学和核磁共振方法因其在分辨率方面的优势，一直处于主导地位，但是两者亦有其局限性。核磁共振方法只能解析一些较小分子量的蛋白质或者核酸结构；而对X射线晶体学来说，如何纯化高浓度、高质量的蛋白样品，筛选合适的晶体生长条件，是结构能否解析的关键。30 nm染色质纤维作为一个超大复合物，显然无法用核磁共振方法解析其结构；同时在现有的技术条件下，制备高质量的晶体从而得到其高精度的晶体结构亦是一件十分艰难的任务。

1975—1999年，冷冻电镜单颗粒成像技术经过了G laeser、Tay lor、Adrian、Dubochet、Downing、Wah Chui和van Heel等多位科学家的努力，逐渐发展成熟。之后，冷冻电子断层成像技术也开始发展[18]。冷冻电镜技术的发展，将结构生物学领域的研究对象由纳米级扩增至百纳米甚至微米级，特别是最近几年冷冻电镜技术的飞速发展，有些生物大分子冷冻电镜结构的分辨率甚至达到了3 Å[19]，已经接近X射线晶体学的分辨率水平。因此，冷冻电镜技术是研究30 nm结构的一把利刃，使其结构的解析成为可能。

2.2 均一样品的制备是关键

体内环境十分复杂，组成核小体的DNA序列和长度存在差异，而且各种染色质结构调控因素交互作用，使得体内天然染色质的结构具有高度的动态性和异质性。鉴于体内天然30 nm染色质纤维结构的复杂性，科学家们在体外建立了一套30 nm染色质纤维组装/重构体系。核小体串珠结构是DNA以左手螺旋缠绕组蛋白八聚体形成的，是染色质的一级结构。为了得到高度均一的染色质纤维，科学家们利用一种含有多个串联的人工设计的601序列DNA为模板。与天然DNA相比，601序列DNA具有很强的核小体定位特性，更容易与组蛋白相互作用形成核小体。核心组蛋白H2A、H 2B、H 3和H4分别在大肠杆菌中表达纯化，并体外组装形成组蛋白八聚体。利用盐透析方法，在体外将DNA模板和组蛋白八聚体按一定比例混合，由2 mol·L-1的NaCl高盐浓度逐级透析到0.6 mol·L-1的NaCl低盐浓度中形成核小体结构。单个核小体的核心颗粒是由147 bp DNA缠绕一个组蛋白八聚体1.75圈形成。研究者所用的DNA模板是12个177 bp 601序列DNA首尾相接串联而成，所以组装形成的核小体核心颗粒之间由30 bp的连接DNA串联。在电镜下观察核小体串珠结构，可以明显看到类似项链一样的串珠结构(图2(a))。

“一个都不能少”，在制备核小体串珠结构中显得尤为重要，必须加入适量的组蛋白八聚体使DNA模板形成饱和的核小体串珠结构，即每一个601序列DNA都和组蛋白八聚体形成稳定的核小体。组蛋白八聚体少了，核小体不饱和，染色质样品就不够均一，这样会影响后面的数据收集和三维重构；相反，如果组蛋白八聚体加多了，染色质又会聚集形成一团乱麻，从而无法给出任何有效的结构信息。

染色质或核小体串珠结构制备好后，向其中掺入H1蛋白，核小体串珠结构就会折叠形成30 nm染色质纤维(图2(b))。这个步骤中加入连接组蛋白H 1的量同样非常重要，一个核小体核心颗粒对应一个H1蛋白，H1少了则结构不均一，无法进行三维重构；H1加多了也会引起染色质的聚集，从而无法观察单个染色质纤维。

一旦得到均一的30 nm染色质纤维样品，就可以进行冷冻电镜观察、数据收集和三维重构。

2.3 冷冻凝固双螺旋之美

“It is here where the art and science of cryo-EM meet.”(冷冻电镜的科学与艺术正是在这里相遇)——van Heel et al. (2000)

制备好的冷冻样品，是结构解析的重要步骤。将用戊二醛固定过的染色质样品加到载体铜网上，然后将铺好样品的铜网瞬间投入液态乙烷中，冷冻速度高达每秒10 000 K。在这个过程中，样品中的水分子还来不及结晶就已经凝固住，可以最大程度地保存样品的结构信息。

图2 30 nm染色质纤维结构的冷冻电镜解析：(a) 镀金属电镜技术观察12-177 bp 601DNA组装形成的核小体串珠结构；(b) 负染电镜技术观察核小体串珠结构在H1存在条件下形成的紧密30 nm染色质纤维结构；(c) 冷冻电镜技术观察核小体串珠结构在H 1存在条件下形成的紧密30 nm染色质纤维结构；(d) H1存在条件下形成的紧密30 nm染色质纤维的三维冷冻电镜结构；(e) 根据30 nm染色质纤维的冷冻电镜结构(d)建立的结构模型及其示意图(标尺：50 nm)

研究者将制备好的冷冻样品放在冷冻电镜下观察，可以看到均一的单个染色质纤维(图2(c))。对于观察者来说，这些分子图像有可能是俯视图，也有可能是侧视图，我们可以假设视野中的不同分子是一个分子的不同角度的呈现。根据这个原理，尽可能多地拍摄分子的2D高清图片，然后将图片中的分子进行分类和其他处理，进而模拟这个分子在3D构象的结构，这就是单颗粒分析技术(SPA)。基于此方法，研究者收集到了足够多的2D数据，然后重构出了30 nm染色质纤维的3D高清结构图，分辨率高达11 Å(图2(d))。冷冻电镜结构显示：30 nm染色质纤维是一个左手双螺旋结构；以四个核小体为基本单元；不同的作用力分别介导了结构单元内部的组装以及结构单元之间的扭转；而核小体结构单元之间的区域或许就是各种表观遗传调节因子的调控区域。同时，研究者还发现，组蛋白H 1在30 nm染色质纤维的形成过程中起着重要的作用。

遗传物质对于生物体来说是至关重要的，这关系着生物体各种性状的延续，所以遗传物质必须有稳定的结构。在自然发展进化过程中，具有稳定性质的双螺旋结构被生物体所选择。30 nm染色质纤维的左手螺旋结构(图2(e))，与DNA的右手螺旋结构类似，这象征着生命之梯的延续，展现出生命的螺旋之美。

3 问题与展望

“橘生淮南则为橘，生于淮北则为枳，叶徒相似，其实味不同。所以然者何？水土异也。”——《晏子春秋》

在淮河以南，橘树可以结出甘甜的橘子，而如果将其移植到淮河以北，结出的果子却是苦涩的。虽然遗传物质一致，但是两者表现出来的性状大不相同。生物界中，类似的现象还有很多：一起长大的同卵双胞胎具有完全相同的基因背景和成长环境，却形成了截然不同的两种性格，一个外向好动，一个却内向喜静，并且对同一疾病具有不同的患病几率；人体所有细胞都来自于同一个受精卵，在发育过程中却向不同的方向分化，形成了神经细胞、肌肉细胞、血细胞等200多种不同的细胞类型，肩负起不同的细胞使命。所有这些现象，都是“种瓜得瓜，种豆得豆”的经典遗传学无法解释的，而属于一门新兴学科——表观遗传学的研究范畴。表观遗传学是一门研究在DNA序列不变的情况下，基因表达发生可继承改变的学科。

染色质好比音符，在表观遗传的调控下呈现出华丽多彩的乐章。基因的转录激活与沉默，使得具有相同基因组的细胞向某一方向定向分化，从而形成不同的组织。细胞核内染色质结构的动态变化与基因的激活和沉默密切相关。因此，研究染色质高级结构，对于理解细胞发育与分化过程中的表观遗传调控机理具有十分重大的意义。

研究者利用冷冻电镜技术解析了30 nm染色质结构的高清晰图谱，这是30 nm染色质结构研究领域取得的重大进展。那体内是否真的存在30 nm染色质结构呢？如果存在，体内的30 nm染色质纤维又是一种怎样的构象呢？这些都是该领域内尚未解决的问题。Eltsov等[20]利用冷冻电镜成像技术观察Hela细胞有丝分裂时期的染色体，发现此时期的染色体高度浓缩，并具有结构均一性，但是并没有发现30 nm染色质纤维的存在。他们认为有丝分裂中期高度浓缩的染色体并不是以30 nm折叠的方式，而是以一种高度无序、相间错杂的状态存在。Frangakis等[21]利用冷冻电子断层扫描技术观察鸡的血红细胞切片，发现在细胞间期存在30 nm染色质纤维，并经计算推测出可能具有two-start左手螺旋结构。由于体内环境的复杂，形成核小体DNA长度的变化，组蛋白变体(如H2A.Z、CENP-A、MacroH2A等)，组蛋白的化学修饰(如泛素化、甲基化等)等因素的存在，30 nm染色质纤维结构也可能存在不同类型。另外，体内的一些染色质结合因子(如HP1等)也可能对其结构起着重要的调控作用。系统地研究表观遗传因子对30 nm染色质纤维高级结构的影响，解析不同状态下30 nm染色质纤维的结构，可以为理解表观遗传调控机制提供结构生物学基础。因此，30 nm染色质高级结构的研究工作具有重大的生物学意义，当然也是任重而道远，需要研究者们的不懈努力。

(2014年6月28日收稿)

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(编辑：段艳芳)

New insights into the higher-order structure of 30-nm chromatin fiber

DONG Li-ping①, CHEN Ping②, LI Guo-hong③
①Ph. D. Candidate, ②Associate Professor, ③Professor, National Laboratory of Biomacromolecules, Institute of Biophysics, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China

Genom ic DNA in the eukaryotic cells is hierarchically folded by histones into chromatin to fi t inside the nucleus. DNA w raps around the histone octamers to form nucleosomes, which are connected by linker DNA to form a “beads-on-a-string”nucleosomal array—the primary structure of chromatin. The nucleosomal array is further folded into a condensed 30-nm chromatin fi ber. In past three decades, the structure of 30-nm chromatin fi ber has been remained as one of the fundamental problems in molecular biology. Based on the early studies of electron m icroscopy, X-ray crystallography and other biophysical methods, two classic structural models have been hypothesized: the solenoid model and the zig-zag model. Here we review the recent research progresses on the structure of 30-nm chromatin fi ber and focus on the recent cryo-EM study of 30-nm chromatin structure which is revealed as a left-handed double helix tw isted by tetra-nucleosome units. In addition, w e discuss the physiological relevance of 30-nm chromatin fi ber in vivo and the perspective on its structural dynam ics in epigenetic regulations.

30-nm chromatin fi ber, solenoid model, zig-zag model, left-handed double helix, cryo-EM, nucleosome, histone H1

10.3969/j.issn.0253-9608.2014.04.006