辣椒花器官发育PAP3基因和PDS基因VIGS载体的构建及鉴定

马宁 刘辰 王茹芳 沈火林

摘 要： 以辣椒恢复系121C为材料，采用RT-PCR技术从121C花药中克隆得到控制花器官发育B类基因PAP3的部分序列，片段长379 bp，阳性对照八氢番茄红素脱氢酶基因（phytoene desaturae，PDS），片段长323 bp，然后通过酶切分别连接pTRV2质粒，获得重组载体pTRV2-pPAP3和pTRV2-PDS。利用PCR进行初步鉴定后进行序列测定。结果表明，辣椒PAP3基因和PDS基因已插入到pTRV2载体上，VIGS载体构建成功。该研究为下一步分析基因沉默和辣椒花器官的发育提供了试验基础。

关键词： 辣椒； PAP3； 病毒诱导基因沉默； 花器官发育

Construction and Identification of Flowering-related PAP3 Gene and

PDS Gene VIGA Vector in Pepper

MA Ning， LIU Chen， WANG Ru-fang， SHEN Huo-lin

（Department of Vegetable Science， College of Agronomy and Biotechnology， China Agricultural University， Beijing 100193， China）

Abstract： In order to study the efficiency of gene-silencing in pepper floral organ development，part of the sequence fragment，length 379 bp，and positive control eight hydrogen lycopene dehydrogenase gene（phytoene desaturae，PDS）fragment，length 323 bp，were obtained from the anther of pepper restore line 121C as materials via semi-quantitative RT-PCR. Connecting two genes individually to the pTRV2 plasmid，vector pTRV2-pPAP3 and pTRV2-PDS were restructured. After the preliminary identification with the help of PCR，the full construct was sequenced for confirmation. The result showed that PDS and PAP3 genes were inserted into the pTRV2 carrier. This study provided the test materials for further analysis in gene-silencing of pepper floral organ development and created a new approach for pepper male sterility breeding.

Key words： Capsicum annuum L.； PAP3； VIGS； Floral organ development

病毒诱导的基因沉默（VIGS）为我们提供了一种快速的沉默目的基因的方法，已被越来越多的用于快速鉴定植物中各种基因的功能。目前该技术在茄科作物上的应用最为广泛，技术流程也相对较为成熟。这种方法是从研究病毒和寄主或转基因之间的相互作用发展而来[1-2]。目前开发的病毒载体主要是RNA病毒，如烟草花叶病毒（TMV），烟草脆裂病毒（TRV），马铃薯X病毒（PVX），大麦条纹花叶病毒（BMSV），卫星烟草花叶病毒（STMV）等。DNA病毒也有研究报道，主要是番茄金黄花叶病毒（TGMV）和甘蓝卷叶病毒（CaLCuV）[3-4]。烟草脆裂病毒（TRV）是现在使用较多的病毒载体，因为该病毒在寄主上侵染后对寄主的影响较温和，而且其寄主范围较广 [5-6]。目前研究表明，一些基因已经成功在辣椒中通过VIGS技术被沉默[7]。

PDS 是类胡萝卜素合成途径中的一个关键酶，如成功将该基因沉默，植株将会表现光漂白症状，最早用来作为指示标记研究 TMV 在烟草上的基因沉默效应。类胡萝卜素在植物中具有光保护作用，当包含 PDS 基因片段的重组 TMV 病毒侵染植物后，PDS 的 mRNA 表达受到抑制，侵染发病的烟草叶片会变成白色。 PDS基因沉默后的植株表型变异易于辨别，因此，该基因是评价 VIGS 体系是否有效的参照基因。

PAP3基因均属于 MADS-box基因家族中控制花器官发育的B类基因，参与花瓣和雄蕊的形成。经研究表明B 类基因丧失功能的突变体中，萼片代替第 2 轮花瓣，第 3轮雄蕊转变为心皮[8-9]。本研究分别构建了PAP3基因和PDS 基因的VIGS载体，并对载体进行鉴定证明其可靠性，将两载体侵染辣椒恢复系植株121C，为下一步分析基因沉默后的辣椒花器官的发育提供试验材料，以便进一步探讨PAP3基因对辣椒花器官发育和雄性不育之间的关系。

1 材料与方法

1.1 材料种植

以辣椒细胞质雄性不育恢复系121C为试验材料（本实验室育种材料）。2011年春季在中国农业大学上庄实验站大棚内常规种植。在开花期，取121C花瓣已开始变白的花蕾，剥取花药立即用液氮冷冻并在-70 ℃ 保存备用，用于基因片段克隆。

1.2 总RNA的提取

总 RNA 的提取依照 SV Total RNA Isolation System kit（美国 Promega 公司）操作说明书进行。基因全长克隆采用 RACE 技术，按照 Smart Race cDNA Amplification Kit（美国 Clontech 公司）试剂盒说明书进行。

1.3 载体构建及鉴定

用于建立病毒诱导的基因沉默 （VIGS） 体系的TRV？载体pTRV1和pTRV2由清华大学刘玉乐教授惠赠。PDS基因VIGS 载体的引物序列为：PDS- F 5‘-GCTTATCTTTGGAGCTCGAGG-3； PDS- R 5‘- CGGGATCCCGCCACCTAGAACATC -3；PAP3基因是本实验室前期研究中通过辣椒不育系和恢复系的差减cDNA文库中获得的辣椒恢复基因诱导的PAP3基因片段。通过RACE技术获得全长，全长克隆到 PMD18？T 载 体中。用于构建PAP3基因 VIGS 载体的引物序列分别为：PAP3-F 5‘- GGAATTCCGCAGGAAGGAGACTACAACT-3； PAP3-R 5‘- CGGGATCCCGAAACATTAAAAGATA-3。PCR 扩增总体系为20 μL，稀释 10 倍的 cDNA 1.0 μL，引物浓度为 10 μmol·L-1各 0.6 μL，2 uTaq PCR Master Mix 10 μL，ddH2O 7.8 μL。PCR 的扩增条件为：94 ℃/3 min；94 ℃/30 s，54 ℃/30 s，72 ℃/45 s，25 cycles；72 ℃/5 min，最后 4 ℃ 保存。PCR 产物用 1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。 扩增得到 的 PCR 产物用 DNA 快速回收纯化试剂盒纯化（Takara，日本），PDS基因和PAP3基因均采用限制性内切酶 EcoRI和BamHI双酶切，连接到同样用EcoRI和BamHI双酶切的pTRV2载体中。将连接产物转化到大肠杆菌 DH5α 感受态中，菌液 PCR 筛选阳性克隆并测序验证，获得序列正确的载体质粒即为重组载体pTRV2-pPAP3和pTRV2-PDS。

2 结果与分析

2.1 辣椒PDS基因和PAP3基因片段克隆及序列分析

根据GeneBank发表的辣椒PDS基因序列（GenBank：x68058），选取PDS基因中部（54～434 bp）序列，以辣椒花药总RNA为模板反转录出的cDNA，通过PCR扩增到目的基因片段长度为323 bp。与预期一致，通过连接载体，双酶切、测序，最终测序结果与发表的基因序列一致，可以用于构建病毒载体（图1）。

图1 PDS目的基因片段的扩增

通过对PAP3序列进行分析选用EcoRI和BamHI这两种内切酶进行酶切位点的连接，连接好酶切位点引物扩增PAP3基因的编码区。以辣椒花药总RNA为模板反转录出的cDNA，通过PCR扩增到目的基因片段PAP3的非编码区为379 bp，包含两个酶切位点对扩增结果进行电泳（图2）及测序分析，得到的PAP3基因片段大小与预期的相同，结合序列分析结果，确定扩增得到了目的基因的片段。

2.2 pTRV2重组载体构建及鉴定

因为农杆菌中质粒的拷贝数较低，所以将PCR扩增的PDS基因和PAP3基因片段转化到大肠杆菌中，当构建TRV病毒载体时，对其进行质粒提取。对pTRV2和从大肠杆菌中所提取的目的基因的质粒同时进行双酶切，再用T4 DNA连接酶进行连接。将连接好的重组载体转化到农杆菌的感受态细胞，通过涂布含有50 μg·mL-1 Kan和25 μg·L-1 Rif的固体YEB培养基进行阳性菌斑的筛选，得到含有重组载体的菌斑，重组的载体结构如图3所示。

图3 目的基因重组病毒载体的结构

利用材料里提两对鉴定引物对病毒载体重组病毒载体pTRV2-pPAP3和pTRV2-PDS进行扩增，另外对载体pTRV1利用引物pTRV1-F 5‘- TTACAGGTTATTTGGGCTAG -3； pTRV1-R 5‘- CCGGGTTCAATTCCTTATC-3进行扩增。扩增结果如图4所示。扩增片段的大小与预期相同。提取电泳检测结果为阳性重组病毒载体的农杆菌的质粒进行测序，测序结果与发表的基因序列一致，可以用于侵染辣椒植株。

图4 目的基因病毒载体片段扩增电泳图

M，100 bp DNA Marker；泳道1～3分别为pTRV1、pTRV2-PDS和pTRV2-pPAP3载体检测结果。

3 讨 论

细胞质雄性不育在植物界中普遍存在，在蔬菜作物的杂种优势利用及品种改良等方面具有重要的经济价值和社会效益，同时在辣椒中，CMS也是研究花粉发育过程及其机理、细胞质遗传、细胞核遗传中应用较多的材料，通过对恢复相关基因的研究也可以成为揭示雄性不育分子机理的突破点，为雄性不育系、雄性不育恢复系的获得提供新的思路和途径，也为其他园艺作物的研究提供了借鉴[10-11]。辣椒为两性花，但雄蕊的不正常发育，会产生不正常的花药或者花粉，以致发生雄性不育。PAP3基因是从实验室已经构建得到的辣椒育性恢复基因诱导表达的cNDA文库中筛选获得的[12]，并以获得基因全长（文章正在投稿），在所有的被子植物中，无论是分化成明显的花萼和花瓣，还是没有明显花萼和花瓣之分的花被中，都检测到AP3类基因的表达。说明在所有的被子植物中，AP3类基因都参与到花瓣状器官的发育过程中。在以拟南芥、金鱼草、矮牵牛等为代表的euAP3基因系列中[13-14]，AP3的表达模式较为固定，一般都在花的第2轮和第3轮表达，同PI类基因共同作用，决定花瓣和雄蕊的发育。

植物中的VIGS是近10年发展起来的快速鉴定植物基因功能的方法，VIGS发生在RNA水平，不改变植物本身的DNA，但是也有报道证实，利用TRV载体进行基因沉默时，其沉默的表型可以维持2年，并且可通过种子将沉默的表型遗传给后代[15]。

本研究通过对辣椒PDS基因和PAP3基因片段克隆及序列分析，构建了pTRV2-pPAP3和pTRV2-PDS重组病毒载体，经测序检测后，载体构建正确可用，旨在为后续研究花器官花瓣和雄蕊发育的PAP3基因的功能提供实验材料，为未来从分子层面调控辣椒育性偍供科学依据。

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