霍山石斛HMGR基因的克隆及其定量表达分析

林榕燕 赖钟雄

摘 要 获得甲羟戊酸生物合成途径中的关键酶基因——3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因的信息是确定该基因与倍半萜类石斛碱含量相关性的重要基础工作。本研究采用RT-PCR结合RACE技术，以霍山石斛原球茎为材料，克隆得到霍山石斛HMGR基因的全长cDNA序列，其在GenBank中的登录号为KF011508。HMGR基因全长2 240 bp，包含144 bp的5′-UTR，407 bp的3′-UTR（含poly A），开放阅读框为1 689 bp，共编码562个氨基酸。生物信息学分析表明：该蛋白可能是定位于细胞质的一种疏水性不稳定蛋白，无信号肽，不含卷曲螺旋结构，具有14个功能位点、27个磷酸化位点，其二级结构由α螺旋、β折叠和无规则卷曲组成。系统进化树分析表明，该基因与黄姜HMGR基因亲缘关系最近，聚为同一类，主要负责催化萜类化合物生物合成途径中的辅酶A和甲羟戊酸的生成。qPCR结果显示：霍山石斛HMGR基因在茎中的表达量最高，而根中的表达量最低。

关键词 霍山石斛（Dendrobium huoshanense）；HMGR基因；克隆；生物信息学分析

中图分类号 S682.31 文献标识码 A

Abstract Obtaining the information of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase（HMGR）gene， a key enzyme gene of the mevalonate biosynthetic pathway， is the basis in studying the relationship between this gene and sesquiterpenoids alkaloids. In this experiment， the full-length cDNA of the HMGR gene was successfully cloned from the protocorm of Dendrobium huoshanense by RT-PCR combined RACE.The accession number（KF011508）of this gene has been registered in GenBank. The full-length of HMGR gene is 2 240 bp， containing 144 bp 5′-UTR， 407 bp 3′-UTR（including poly A）and a 1 689 bp open reading frame， which encoding 562 amino acids. Bioinformatics analysis showed that the protein is likely a kind of hydrophobicity and unstable protein located in the cytoplasm. This protein has 14 functional sites and 27 phosphorylation sites， but has no signal peptide and coil helix structures. The secondary structure was constituted by α- helix， β- folding and random coil. The phylogenetic tree analysis showed that this gene has the closest relationship with HMGR of Dioscorea zingiberensis，which is mainly catalytic the produce of coenzyme A and mevalonate in the terpenoid biosynthetic pathway. qPCR results showed that the expression level of HMGR gene from Dendrobium huoshanense was highest in stem while lowest in root.

Key words Dendrobium huoshanense； HMGR genes； Cloning； Bioinformatics analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.10.016

霍山石斛（Dendrobium huoshanense）属兰科石斛属多年生草本植物，产于安徽省霍山县，是国家重点保护的传统名贵药用植物[1]，也是历代本草中记述最多、最为详尽的一种石斛。霍山石斛药用价值极高，功效奇特，资源稀少，价格昂贵，素有“中华仙草之最”的美称[2]，其应用范围正迅速扩大，需求量不断增加，是众多保健药品和保健食品的主要原料之一[3-5]。但是霍山石斛对生长条件要求十分苛刻，加上人工过度采挖，其野生资源已濒临灭绝[6]。石斛属植物中的倍半萜类生物碱是其主要有效成分之一，但含量一般较低[7]，因此通过基因工程手段提高倍半萜类生物碱的含量具有重大意义。

植物萜类化合物合成主要通过甲羟戊酸（MVA）途径和脱氧木酮糖-5-磷酸（DXP）途径，在这2种途径中，异戊二烯焦磷酸（IPP）是主要中间产物，由其生成单萜、倍半萜、二萜、三萜等化合物[8]。3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGR）是甲羟戊酸（MVA）途径中的限速酶[9]，能够在甲羟戊酸途径中催化3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A（HMG-CoA）生成甲羟戊酸。目前，HMGR已经从马铃薯、红豆杉、橡胶树等多种植物中克隆出来[10-13]。大量研究表明，HMGR也是甲羟戊酸途径中的一个关键调控位点，在植物萜类的生物合成方面具有重要的调控作用。将长春花HMGR基因转到青蒿中，可以使青蒿中的青蒿素含量显著提高[14]。在烟草中超表达阳春砂的HMGR基因，结果发现单萜、倍半萜、二萜、甾醇及植醇的总含量都提高了[15]。但目前还未有HMGR基因从霍山石斛中克隆得到的相关报道。

本研究从倍半萜类生物碱生物合成途径出发，采用RT-PCR结合RACE技术克隆得到霍山石斛倍半萜类生物碱生物合成途径中的关键酶基因（HMGR）的全长cDNA，并进行生物信息学和定量表达分析，希望为后续霍山石斛HMGR基因的功能验证以及倍半萜类生物碱合成代谢工程改良奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料为霍山石斛原球茎，由福建农林大学园艺植物生物工程研究所提供。将试验材料放于继代培养基中培养50 d后，取生长旺盛的原球茎为材料进行试验。继代培养基的配方为1/2 MS+0.5 mg/L 6-BA，其中蔗糖20.0 g/L，琼脂粉6.0 g/L，pH值5.7，温度（25±2）℃，光照时间12 h/d，光照强度1 200～2 000 lx。

1.2 试验方法

1.2.1 霍山石斛原球茎RNA的提取及cDNA的合成

采用Tripure法[16]进行霍山石斛原球茎总RNA的提取，提取得到的总RNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，经分光光度计检测其纯度。而后直接用于cDNA第一链的合成或置于-80 ℃条件下保存备用。保守区扩增、3′RACE以及开放阅读框（ORF）验证过程中所用的cDNA的合成都是采用RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas）试剂盒，5′RACE 所需cDNA的合成采用System for Rapid Amplification of cDNA Ends，Version 2.0的试剂盒进行，产物均置于-20 ℃保存。

1.2.2 霍山石斛HMGR基因的引物设计及PCR扩增 从NCBI上下载与霍山石斛相关的HMGR基因序列，根据同源克隆的原则设计基因保守区的上下游引物。根据HMGR基因保守区的测序结果设计3′RACE的2条正向特异引物以及5′RACE的2条反向特异引物。将获得的目的基因的5′RACE序列、ORF验证序列及3′RACE序列采用DNAMAN 软件进行拼接，得到该基因的cDNA全长，并在ORF外或起始密码子和终止密码子处分别设计一对引物用于ORF的扩增。本研究所用的引物见表1。

以反转录的cDNA为模板，进行PCR扩增。PCR扩增程序为：94 ℃预变性 4 min；94 ℃变性 45 s，退火45 s，72 ℃延伸1 min/kb；共35个循环；最后72 ℃延伸10 min，10 ℃保持1 h。各环节的退火温度及延伸时间见表1。PCR扩增产物通过琼脂糖（1%）电泳进行检测。采用DNA快速纯化回收试剂盒（Solarbio）回收目的片段，以pMD-18T（TaKaRa）连接载体，Escherichia coli（DH5α）感受态（TianGen）对回收片段进行连接、克隆和转化。阳性克隆子送上海博尚生物公司测序完成。

1.2.3 生物信息学分析 利用在线ExPASy（http：//www.expasy.org/resources/）蛋白分析软件ProtParam、ProtScale、COIL、SWISS-MODEL对蛋白进行理化性质分析和卷曲结构、三维结构预测；利用在线CBS Prediction Servers蛋白分析软件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/）中的SignalP、TMHMM、NetPhos对蛋白进行信号肽、跨膜结构预测和磷酸化位点分析；利用http：//psort.hgc.jp/form.html进行亚细胞定位；利用NCBI的Conserved Donain Search在线软件（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）进行蛋白保守结构域的预测；利用PredictProtein（http：//www.predictprotein.org/）对该蛋白的功能位点和二级结构进行预测；并利用MEGA5.0软件构建系统进化树。

1.2.4 霍山石斛不同组织材料的HMGR基因定量表达分析 本研究以18S rRNA为内参基因，检测目的基因HMGR在霍山石斛试管苗不同组织中的相对表达量。采用Takara SYBR ExScript试剂和罗氏LightCycler480仪器，以霍山石斛的老叶、幼叶、根和茎稀释后的cDNA作为模板，HMGR-F和HMGR-R作为上下游引物进行qPCR扩增，具体操作流程参照吴高杰[16]的研究。反应结束后进行溶解曲线、扩增曲线等的分析，检测引物的特异性。在样品扩增反应前先以试验中不同cDNA模板的混合样不同稀释倍数进行标准曲线的制作，以上每个反应包括3个重复。

2 结果与分析

2.1 霍山石斛原球茎总RNA的提取

提取得到的霍山石斛原球茎总RNA，其A260/A280值在2左右，A260/A230值大于2，质量较好，28 S rRNA和18 S rRNA条带都较清晰，且28 S rRNA条带亮度约为18 S rRNA 2倍。RNA在-80 ℃条件下保存备用。

2.2 霍山石斛原球茎HMGR基因cDNA全长序列的获得

以反转录合成的保守区cDNA 第一链为模板，采用相应的引物扩增得到约544 bp 的特异性条带，经NCBI数据库比对，确定其为目的条带。根据保守区序列设计引物，进行5′和3′扩增，经测序后分别得到1 048 bp和1 080 bp的目的条带。将所获得的HMGR基因的3′RACE、保守区序列和5′RACE序列进行拼接，而后根据拼接的全长序列设计相应的ORF验证引物，扩增得到1 754 bp左右的特异性条带，测序结果在GenBank数据库中在线进行Blast，结果表明所得片段为霍山石斛HMGR基因序列。该cDNA全长2 240 bp，包含144 bp的5′UTR，一个完整的共1 689 bp的 ORF（145-1833），以及407 bp的3′UTR（含poly A）。该cDNA序列共编码562个氨基酸，已登录GenBank，登录号为KF011508。

2.3 霍山石斛原球茎HMGR氨基酸序列比对

选取包括霍山石斛在内的7种植物的HMGR氨基酸序列，利用DNANAN软件对其进行序列多重比对分析。用不同颜色深浅背景来表示其相似性的高低，颜色越深相似性越高，相似性最高的地方可能存在着重要功能结构域。分析结果表明，不同植物的HMGR之间具有较高的相似性，其相似性达到75.67%（图1）。并且，在所选择的7种植物中，霍山石斛与同属于兰科的铁皮石斛和万代兰的相似性较其它植物高。同时发现，霍山石斛HMGR的功能域氨基酸组成与其它植物几乎一致，即两个HMG-CoA结合基序-EMPVGYV/IQL/IP和TTEGCLVA（图中用方框表示），两个NADPH结合基序-DAMGMNM和GTVGGGT（图中用下划线表示）。

2.4 霍山石斛原球茎HMGR基因生物信息学分析

2.4.1 蛋白质基本理化性质分析 利用ProtParam对霍山石斛HMGR蛋白质进行理化性质分析，发现该蛋白由562个氨基酸组成，分子量为60.0 ku，理论等电点为8.41，由20种氨基酸组成，其中Ala、Leu和Ser所占比重较大，比例分别达到10.5%、10.3%和9.4%，Trp含量最低。负电荷氨基酸残基总数为（Asp+Glu）为51，正电荷的总数（Arg+Lys）为56，分子式：C2 651H4 269N727O792S33，原子总数：8 472。预测结果还显示该蛋白不稳定系数为40.42，高于域值40，是一个不稳定蛋白；脂肪系数为93.58；总平均疏水指数（GRAVY）为0.125，表明它是一个疏水蛋白。

利用ProtScale对蛋白的亲水性和疏水性进行预测，结果表明：在第88个氨基酸表现为疏水性最强，为2.733；在第549个氨基酸表现为亲水性最强，为-2.256，并且疏水氨基酸的数量大于亲水氨基酸的数量，所以推断HMGR蛋白为疏水性蛋白，其结果与ProtParam软件中预测的相似。

2.4.2 跨膜结构预测分析 利用TMHMM工具对霍山石斛HMGR蛋白的跨膜结构进行预测（图2），结果表明：HMGR可能会在81～103位氨基酸处形成一个跨膜螺旋，HMGR蛋白的跨膜螺旋氨基酸期望值为41.387 87远大于18，因此该蛋白很可能是一个跨膜蛋白。从N末端开始的前60个氨基酸期望值（Exp number，first 60 Aas）为9.425 54，小于10，因此可以预测霍山石斛HMGR蛋白不具有信号肽的序列，其中81～103处的跨膜螺旋可形成N末端在膜内的跨膜螺旋的概率达到了0.570 38，由此也可以推断霍山石斛HMGR蛋白可能是一个跨膜蛋白。

2.4.3 信号肽预测分析 运用SignalP 4.1 Server对霍山石斛HMGR蛋白的信号肽进行预测。结果如下：霍山石斛HMGR剪切位点值（C值）最大为0.114，Y值（综合考虑S值和C值的一个参数）最大为0.120，从N端氨基酸开始到剪切位点（1～10位）各氨基酸的平均值（Smean）为0.132，此段的D值（S平均值和Y最大值的加权平均值）达到了0.125，小于0.5。由此看出，霍山石斛HMGR蛋白不含有信号肽，推断其不是分泌蛋白，该蛋白可能是在细胞质中合成后保留在细胞质基质中，而不参与细胞内的运输作用。对其它植物的HMGR氨基酸序列的信号肽进行分析也得到了一样的结果，即HMGR不具有信号肽。

2.4.4 亚细胞定位预测分析 蛋白质只有处于特定的亚细胞位置才能发挥其功能，故亚细胞定位对蛋白质的功能研究存在着十分重要的意义[17]。运用PSORT软件对霍山石斛HMGR蛋白的亚细胞定位进行预测，结果表明：霍山石斛HMGR定位于线粒体内膜的可能性最大，为68.8%。其次是细胞膜，可能性为60.0%。定位于高尔基体和叶绿体类囊体膜的可能性较低，分别为40.0%和30.9%。由此可以推测该蛋白主要在细胞质中参与代谢活动。

2.4.5 磷酸化位点和功能位点的预测分析 蛋白质磷酸化是蛋白质翻译后修饰的重要内容之一，其对蛋白质活力和功能有着重要的调节和控制作用[18]。利用NetPhos 2.0 Server预测霍山石斛HMGR蛋白的磷酸化位点，结果表明在多肽链中可能发生磷酸化的有丝氨酸（Ser）、苏氨酸（Thr）和酪氨酸（Tyr），其中以丝氨酸磷酸化位点最多，有18个，预测的最高分达到0.995，在第109位氨基酸处；其次是苏氨酸，达到7个磷酸化位点，分别为第16、44、184、237、277、395、412位氨基酸处；酪氨酸的磷酸化位点只有2个，分别在第198和212位氨基酸处。

通过PredictProtein在线软件对霍山石斛HMGR蛋白功能位点进行预测与分析。结果表明，该蛋白含2个N-糖基化位点（ASN_Glycosylation）、11个蛋白激酶C 磷酸化位点（PKC_Phospho_site）、5个蛋白激酶II 磷酸化位点（CK2_ Phospho_site）、10 个N-酰基化位点（Myristyl）、1个羟甲基戊二酸辅酶A还原酶信号1位点、1个羟甲基戊二酸辅酶A还原酶信号2位点和1个羟甲基戊二酸辅酶A还原酶信号3位点。

2.4.6 保守结构域的预测分析 蛋白结构与其发挥的功能密切相关，结构的保守性与功能的保守性呈正相关。通过NCBI-CDS在线软件分析霍山石斛HMGR蛋白的保守结构域，结果发现该蛋白含有典型的HMG-CoA_reductase_class1保守结构域（第146～549位），该基因序列主要负责催化萜类化合物生物合成途径中的辅酶A和甲羟戊酸的生成。这些结果进一步说明了本实验克隆所得的霍山石斛HMGR基因属于HMGR基因家族（图3）。

2.4.7 卷曲螺旋的预测分析 利用COILS对霍山石斛HMGR蛋白进行蛋白卷曲螺旋预测，结果显示：霍山石斛HMGR蛋白在window=14、21和28时，形成卷曲螺旋的预测概率都较低，均远低于0.5，说明霍山石斛HMGR蛋白不能形成卷曲螺旋结构。

2.4.8 二级结构和三级结构的预测分析 蛋白质二级结构对于深入研究蛋白质的生物活性具有重要作用。利用PredictProtein对霍山石斛HMGR蛋白的二级结构分析的结果为：HMGR的结构由α螺旋、β折叠和无规则卷曲组成。在整个蛋白中，α螺旋和无规则卷曲所占比例较大，分别为45.91%和41.64%，而β折叠只占12.46%。

以人类（Homo sapiens）的HMGR（2q6bA）作为模型，利用SWISSMODEL对霍山石斛HMGR蛋白进行同源建模，得到其三维结构如图4所示。可以看出该蛋白的主要结构元件是α螺旋、β折叠和无规则卷曲。

2.4.9 系统进化树的构建 将从NCBI数据库中下载具有代表性的物种的HMGR蛋白与霍山石斛HMGR的编码蛋白，采用MEGA5.0软件分析构建HMGR的系统进化树（图5）。从进化树结果可以看出，HMGR根据种属关系被准确的分为植物、动物和真菌3大类，霍山石斛HMGR与黄姜HMGR的亲缘关系比较近，聚为同一类，因此可以推测霍山石斛HMGR与黄姜HMGR的功能间具有一定的相似性，在甲羟戊酸途径中起到调控作用。

2.4.10 霍山石斛试管苗不同组织中HMGR基因定量表达分析 在溶解曲线、扩增曲线及标准曲线满足试验要求的前提下，以18 S rRNA为内参基因，检测霍山石斛试管苗不同组织中HMGR基因的表达水平，其相对表达量见图6。HMGR基因在茎中的相对表达量最高，叶次之，且幼叶要高于老叶，根中最少。

3 讨论与结论

3.1 霍山石斛HMGR蛋白的结构功能预测

HMGR基因作为萜类生物合成途径中的关键酶基因而倍受关注，目前已从巴西橡胶树、马铃薯、红豆杉等植物中分离克隆。将获得的霍山石斛HMGR基因ORF推导的氨基酸序列登录到NCBI网站，用BLAST进行蛋白质相似性检索，发现该序列与金钗石斛（AFD23288.1）的相似性最高达到了97%，与其他植物比较也具有较高的相似性，基本都到达70%。序列和结构较高的相似性说明HMGR基因在植物中具有很高的保守性，说明本次克隆得到的HMGR基因序列准确可靠，属于HMGR基因家族的一员。

从生物信息学的角度对核酸和氨基酸序列进行分析，并对其结构和功能进行预测，可为生命现象的本质提供一定的理论参考依据[19]。对霍山石斛HMGR蛋白进行生物信息学分析，发现该蛋白属于疏水性的跨膜蛋白，不含信号肽结构，推断其是一种在细胞质中直接行使其作用的蛋白。对其它植物HMGR的生物信息学进行分析得到一样的结论。在重要功能域方面，霍山石斛HMGR拥有与其他植物几乎相似的氨基酸组成，即2个HMG-CoA结合基序（EMPVGYVQLP和TTEGCLVA）和2个NADPH结合基序（DAMGMNM和GTVGGGT）。有研究表明，TTEGCLVA中的谷氨酸Glu在HMGR起催化作用过程中占据重要位置[20]。本研究获得的霍山石斛HMGR基因的序列信息以及结构分析，可为后期通过分子生物学手段调节HMGR的基因表达，进而研究HMGR基因的表达水平与倍半萜类石斛碱含量的相关性，从而提高倍半萜类石斛碱的含量奠定基础。

3.2 HMGR基因与霍山石斛倍半萜类生物碱合成的相关性

MVA途径长期以来被认为是萜类化合物合成的重要途径，而HMGR基因则被认为是该途径中的一个重要调控点，其表达水平与许多萜类化合物生物合成密切相关。在研究青蒿素生物合成代谢中发现，HMGR作为该途径的限速酶，其酶活性的调节影响细胞中甲羟戊酸的储蓄和青蒿素的积累[21-23]。在丹参的毛状根中超表达HMGR基因，发现不仅植物酶活性提高，丹参酮和角鲨烯的产量也有所增加[24]。杜娟[25]在对蹄叶橐吴萜类化合物-紫菀酮的研究中发现相比于野生型对照植物，超表达HMGR基因的转基因植株中紫菀酮的含量较多。将N端缺失的HMGR基因在转基因薰衣草中过表达，结果促进了薰衣草精油及植物甾醇的产生[26]。

为了解HMGR基因与霍山石斛倍半萜类生物碱合成的相关性，本研究对霍山石斛不同组织中HMGR基因进行了定量表达分析，结合丁亚平[27]等对霍山石斛不同组织中生物碱含量的研究发现，HMGR基因在叶和茎中的表达水平要明显高于根中，而生物碱含量为叶>茎≈根。导致该现象的可能原因有：霍山石斛生物碱的生物合成是经过多步生化反应后才完成的，HMGR的催化作用处于较上游，其后还有多种酶的相互协同作用影响着生物碱的合成；霍山石斛生物碱的合成除了通过MVA途径外，还可能通过MEP途径和莽草酸途径。

参考文献

[1] 袁 超. 亟待保护与开发的濒危中草药——霍山石斛[J]. 安徽科技， 2001， 9： 21.

[2] 包雪声， 顺庆生， 陈立钻， 等. 中国药用石斛图志[M]. 上海： 复旦大学出版社， 2001： 75

[3] Wang Y， Luo J P， Zha X Q. Protocorm-like body formation and plant regeneration of Dendrobium huoshanense， an endangered medicinal plant[J]. Acta Horticulture， 2006， 725： 379-384.

[4] 陈凤芹， 黄德武， 何 苗， 等. 霍山石斛胶囊抗过氧化作用的研究[J]. 动物医学进展， 2007， 28（10）： 54-58.

[5] Zha X Q， Luo J P， Luo S Z. Stucture identification of a new immunostimulating polysaccharide from the stems of Dendroobium huoshanense[J]. Barbohydrate Polymers， 2007， 69： 86-93.

[6] Bi Z M， Wang Z T， Xu L S. Chemical constituents of Dendrobium monili forme[J]. Acta Botanica Sinica， 2004， 46（1）： 124.

[7] 魏小勇. 石斛属植物生物碱研究进展[J]. 中国药事， 2005， 19（7）： 445-447.

[8] 占爱瑶， 由香玲， 詹亚光. 植物萜类化合物的生物合成及应用[J]. 生物技术通讯， 2010， 21（1）： 131-135.

[9] Chappell J， Wolf F， Proulx J， et al. Is the reaction catalyzed by 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase a rate-limiting step for isoprenoid biosynthesis in plants[J]. Plant Physiol， 1995， 109： 1 337-1 343.

[10] Korth K L， Stermer B A， Bhattacharyya M K， et al. HMG-CoA reductase gene families that differentially accumulate transcripts in potato tubers are developmentally expressed in floral tissues[J]. Plant Molecular Biology， 1997， 33（3）： 545-551.

[11] Liao Z H， Tan Q M， Chai Y R， et al. Cloning and characterization of the gene encoding HMG-CoA reductase from Taxus media and its functional identification in yeast[J]. Functional Plant Bio， 2004， 31（1）： 73-81.

[12] Venkatachalam P， Priya P， Jayashree R， et al. Molecular cloning and characterization of a 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase 1（hmgr1）gene from rubber tree（Hecea brasiliensis Muell.Arg.）： A key gene involved in isoprenoid biosynthesis[J]. Physiology and Molecular Biology of Plants， 2009， 15（2）： 133-143.

[13] Cao X Y， Zong Z M， Ju X Y， et al. Molecular cloning， characterization and function analysis of the gene encoding HMG-CoA reductase from Euphorbia Pekinensis Rupr[J]. Molecular Biology Reports， 2010， 37（3）： 1 559-1 567.

[14] Aquil S， Husaini A M， Abdin M Z， et al. Overexpression of the HMG-CoA reductase gene leads to enhanced artemisinin biosynthesis in transgenic artemisia annua plangts[J]. Planta Medica， 2009， 75（13）： 1 453-1 458.

[15] 刘 卉. 阳春砂HMGR和DXR基因在烟草萜类化合物生物合成中的功能研究[D]. 广州： 广州中医药大学， 2012.

[16] 吴高杰. 石斛兰离体培养条件优化及其离体培养物的microRNA研究[D]. 福州： 福建农林大学， 2012.

[17] 李立奇， 万 瑛 .蛋白质的亚细胞定位预测研究进展[J]. 免疫学杂志， 2009， 25（5）： 602-604.

[18] 梁前进， 王鹏程， 白燕荣. 蛋白质磷酸化修饰研究进展[J]. 科技导报， 2012， 30（31）： 73-79.

[19] 李 嵘， 王 之. 植物萜类合成酶3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的生物信息学分析[J]. 广西植物， 2006， 26（5）： 464-473.

[20] 蒋 春， 张华玲， 彭 江. 尾巨桉HMGR基因的克隆及表达分析[J]. 广西植物， 2012， 32（1）： 113-117.

[21] Alam P， Abdin M Z. Over-expression of HMG-CoA reductase and amorpha-4， 11-diene synthase genes in Artemisia annua L. and its influence on artemisinin content[J]. Plant Cell Reports， 2011， 30（10）： 1 919-1 928.

[22] Ram M， Khan M A， Jha P， et al. HMG-CoA reductase limits artemisinin biosynthesis and accumulation in Artemisia annua L. plants[J]. Acta Physiol Plant， 2010， 32（5）： 859-866.

[23] Nafis T， Akmal M， Ram M， et al. Enhancement of artemisinin content by constitutive expression of HMG-CoA Reductase gene in high yielding strain of Artemisia annua L[J]. Plant Biotechnology Reports， 2011， 5（1）： 53-60.

[24] Zhubo D， Guanghong C， Shu F Z， et al. Cloning and characterization of a novel 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase gene from Salvia miltiorrhiza involved in diterpenoid tanshinone accumulation[J]. Journal of Plant Physiology， 2011， 168（2）： 148-157.

[25] 杜 娟. 蹄叶橐吴萜类化合物合成相关基因克隆及功能研究[D]. 吉林： 吉林大学， 2007.

[26] Munoz-Bertomeu J， Sales E， Ros R， et al. Up-regulation of an N-terminal truncated 3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA reductase enhances production of essential oils and sterols in transgenic Lavandula latifolia[J]. Plant Biotechnology Journal， 2007， 5（6）： 746-758.

[27] 丁亚平， 杨道麒， 吴庆生， 等. 安徽霍山三种石斛总生物碱的测定及其分布规律研究[J]. 安徽农业大学学报， 1994（04）： 503-506.