疑有禽白血病病毒混合感染的肉种鸡大肝大脾病

秦卓明 仉伟 刘霞 马秀丽 黄兵 李玉峰 徐怀英

摘 要：山东某父母代肉种鸡开产后死淘率突然升高，死亡鸡肝脏、脾脏、腺胃等内脏器官肿大，高峰期周产蛋率仅为72%，明显低于同场区未发病鸡群的83%，更显著低于其标准产蛋率（87%）。利用RT-PCR技术对肿大的脏器分别进行分子病原学诊断，禽网状内皮增生症病毒、戊型肝炎病毒和马立克氏病毒等PCR检测结果阴性，而ALV pol基因检测阳性，经测序与GenBank已发表的ALV E亚群毒株的核苷酸同源性高达97.5%～99.5%。血清学检测证实， ALV-AB亚群在发病前阳性率为8.3%，而发病后的抗体阳性率则攀升为70%。鸡群发病后的种蛋蛋清p27抗原检测ALV阳性率为5.3%。综上所述，鸡群可能混合感染ALV。

关键词：肉种鸡；禽白血病；pol基因；混合感染

中图分类号：S858.31 文献标识码：B 文章编号：1673-1085（2014）11-0006-05

禽白血病（Avian leucosis virus，ALV）是由反转录病毒科禽白血病/肉瘤病毒群病毒引起的禽类多种肿瘤性疾病的总称，具有感染率高、发病率低等特点。它即可诱发产生肿瘤，造成鸡只的死亡，又可产生非肿瘤综合症，导致鸡群生长发育不良，影响生产性能[1-3]。禽白血病一般分为两大类：一类为A、B、C、D和J亚群等外源性病毒，具有致病性；另一类为E亚群，属内源性病毒，主要以前病毒的形式存在，对鸡几乎不致病，但可以加重ALV其他亚群和其他病原的感染[4，5]。

2011年初至2012年11月以来，山东省十多个父母代肉种鸡场发生大肝大脾病。临床主要表现为：20周龄以后的鸡，鸡体消瘦、生长发育不良、产蛋下降、死淘率升高，缺乏产蛋高峰等。剖检可见发病鸡肝脏和脾脏肿大、腺胃肿大，个别鸡出现卵黄性腹膜炎和腹腔有血凝块等。康复鸡群多数产蛋达不到指标，加之死淘增高，后代雏鸡质量差等，经济损失巨大。现结合一个鸡场的实例，进行病原分析，以期找出针对性防控措施。

1 材料和方法

1.1 病料来源和病毒分离 病料来自山东某父母代肉种鸡场，所采组织为死淘鸡的可疑肿瘤病变组织，主要包括肝脏、脾脏、腺胃等。采集的肿瘤等病变组织，一部分进行病原学分离和分子病原诊断；另一部分，利用10%福尔马林固定，进行组织病理学检查。

1.2 病毒分离和鉴定

1.2.1 病毒分离纯化 将病变的肿瘤组织用生理盐水匀浆，反复冻融3次，离心取上清，加双抗10000U/ml过夜处理。将上述新鲜病料接种已长成单层的DF-1细胞，0.2ml/瓶，37℃孵育2h后弃掉病毒液，加入含1%胎牛血清的DMEM维持液。在37℃继续培养7～9d后，将细胞反复冻融3次收获，继续传代至2代病毒，-80℃保存。同时，利用IDEXX公司ALV p27抗原检测试剂盒进行检测。

1.2.2 分子病原学鉴别诊断 根据ALVpol基因保守序列设计一对特异性引物，正向引物：5' ACTGCTGCCTTGGAACGATG3'；反向引物： 5' AAGCCGCCGCTGTAGACG 3'。将1.2.1中的病变组织处理液提取总RNA，进行RT-PCR反应，扩增产物于1%琼脂糖凝胶电泳分析。同时，参考已经发表的文献设计特异性引物如马立克病毒（MDV）、网状内皮组织增生症病毒（REV）、戊型肝炎病毒（HSS）等进行扩增，进行分子鉴别诊断[6-8]。

1.3 鸡群的跟踪检测

1.3.1 种蛋蛋清p27抗原检测 收集该发病鸡群所产种蛋92枚，用IDEXX公司ALV p27抗原试剂盒进行检测。

1.3.2 发病鸡群发病前后的不同病原抗体变化 采集鸡群发病前血清60份和发病后140份，按照IDEXX公司ALV-AB亚型和ALV-J亚型抗体检测试验盒操作说明进行检测。

1.4 ALV plo基因核苷酸序列比较和系统进化 将分离株的pol核苷酸序列与GenBank中已发表的ALV不同亚群序列利用DNAstar Lasergen6.0软件进行同源性分析，并利用Mega5.0依据核苷酸同源性绘制系统进化树。

2 结果

2.1 临床发病概况 山东某父母代肉种鸡场，品种为罗斯308。自22周龄开始，死淘率逐渐增高，31周龄达到高峰，最高周死淘率接近1%，随后，死淘逐渐减少。临床表现为：肉种鸡鸡体消瘦、精神萎靡不振，鸡冠、肉髯苍白，食欲减少，产蛋上升缓慢，缺乏产蛋高峰。表1显示的是饲养在同一场区健康组和发病组24～34周龄生产指标比较。在生产性能方面，发病组群鸡最高周产蛋率仅为72%，远低于该品种标准生产性能的87%，同时也低于同场饲养的未发病健康组鸡群（高峰周产蛋率为83%）。

2.2 临床剖检特点 死亡鸡群通常十分消瘦，鸡冠苍白，伴有拉稀症状。剖检可见肝脾肿大，色泽多样，质度不等（图1A和F）；有的肝脏表面有白色结节（图1D和E）；有的脾脏表面有白色小点（图1C）；胆囊充盈；腺胃肿大质硬，腺胃乳头糜烂（图1B）。卵泡变性，卵泡膜未见出血，少数鸡卵巢萎缩；卵黄性腹膜炎多见，腹腔内存在肝破裂血凝块。健康组尽管也有死淘鸡，但大多以卵黄性腹膜炎为主要症状，未见内脏器官肿大等病症。

图2显示的是肿瘤在发病组死淘鸡中所占的比例。结果发现：在死淘鸡的病理剖检中，发生肿瘤的比例基本维持在40%～60%，平均为49.6%。而健康未发病组却不存在这种现象。由此推测，肿瘤是鸡群死淘率较高和生产性能差的重要原因。

病理组织HE染色后镜检发现：从肝脏中可见大量增生的髓细胞瘤细胞，且大量聚集，呈结节灶性分布，主要见于血管周围，有的呈弥漫性浸润，细胞核较大，较疏散。脾脏中亦可见淋巴细胞弥散性分布，红髓血窦。此外，腺胃中的淋巴细胞则呈弥散性分布。

2.3 ALV p27抗原检测和抗体跟踪 由表2可知：发病后32周龄鸡群的92个种蛋，其ALV p27抗原阳性率为5.4%（5/92）。抗体检测表明：发病前后ALV-J检测均为阴性，而ALV-AB抗体阳性率发病前为8.3%（5/60），发病后攀升为70%（98/140），但未分到ALV A/B亚群病毒。

2.4 ALV病原分离 RT-PCR特异性ALV诊断表明，肿瘤样品可扩增到大小为662bp的目的条带，ALV检测结果为阳性（图3），经测序分析为ALV，命名为SDBD 2012。阳性样品接种DF1细胞进行病毒分离。从感染SDBD 2012的DF-1细胞中提取前基因组DNA，PCR扩增env基因中的gp85基因，未扩增出目的条带。

2.5 ALV pol核苷酸同源性比较及其遗传进化关系分析 SDBD 2012株的pol基因经测序为672bp。与GenBank中已发表的鸡的17个不同亚群ALV的参考株核苷酸同源性比较表明，该毒株与YG6100、E-B9等国际较早发现的ALV内源性E亚群代表株的核苷酸同源性高达99.5%，与2env、1/2env等 美国ALV E亚群经典代表株的核苷酸同源性也较高，为99%。而与国内1997-2009年流行的常见J亚群代表株同源性仅为97.5%～98%（详见图4）。

根据Mega5.0，绘制系统进化树（图5），分析不同毒株之间的遗传进化关系。结果显示，该分离株与E亚群代表株亲缘关系较近。

3 讨论

3.1 病原学和血清学跟踪调查 对发病鸡群所产的种蛋进行检测，蛋清ALV p27抗原阳性率为5.3%，证实有ALV感染。利用ALV A/B亚群ELISA抗体试剂盒检测发病前后鸡群的抗体，A/B亚群的阳性率由8.3%攀升到70%，从血清学角度证实可能有A/B亚型ALV感染，但未分离病毒。我国白羽肉鸡的种源全部来自国外，J亚型ALV十分普遍[9，10]，但在多个流行大肝大脾的肉种鸡场，J亚群ALV抗体检测在发病前后大都为阴性，反应出此次流行的鸡大肝大脾病可以完全排除J亚群ALV的混感。

3.2 ALV E亚群感染 本实验尽管通过RT-PCR技术证实了ALV的存在，系统进化分析证实分离株与E亚群ALV遗传距离较近。由于未分到ALV病毒，尚不能克隆gp85基因的序列（型决定基因），因此，不能从病原学的角度肯定E亚群ALV的存在。是否存在E亚群ALV的混合感染值得商榷？但已有大量的证据显示，E亚群ALV的存在肯定会增强A/B亚群的协同感染[2，4]。至于这些基因片段是来自游离的E亚群ALV，还是来自细胞染色体上固有的序列，尚需要更深入的工作。

3.3 戊型肝炎 此次鸡群发生的鸡大肝大脾病症在临床发病、病理剖检和组织病理学等方面，与戊型肝炎（Hepatitis spleonomegaly synarones， HSS）所导致的病症十分相似。淋巴样细胞浸润是本次鸡群发病的主要组织病理学特征，而该特征也是戊型肝炎的特征性病变之一。值得一提的是：上述病理变化与ALV的A/B亚群很难区分，二者均为淋巴细胞瘤，而与J亚群ALV不同，后者主要是骨髓样细胞瘤。因此，尽管戊型肝炎RT-PCR和病原分离均未成功，但并不排除戊型肝炎混合感染的可能性。

3.4 协同感染 大肝大脾病的发生原因比较复杂，很可能是多因素的叠加或是长期的积累。由于单一因素的感染所致的损失相对较轻，而多因素混合作用则会导致严重的后果。本研究对容易产生肿瘤的网状内皮增生症、马立克和戊型肝炎等进行了检测，RT-PCR均未检测到病毒核酸。但是，这不等于说在病理剖检和组织学病变方面可完全排除戊型肝炎等感染的可能性。由于致肿瘤性病病毒分离培养极为困难，耗时长，成本高，因此，综合目前临床发病情况和实验室检测结果，混合叠加感染的可能性是最大的。

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