MCL—1在口腔鳞状细胞癌中的表达及意义

郑军 邬丽苹 王天霆

[摘要]目的：探讨MCL-1在口腔鳞状细胞癌（Oral squamous cells carcinoma，OSCC）组织中的表达情况及意义。方法：采用免疫组织化学和实时荧光定量PCR技术，检测OSCC和口腔正常黏膜组织中MCL-1蛋白及mRNA的表达。结果：MCL-1蛋白在OSCC组织中的阳性表达率为61.9%（52/84），在口腔正常黏膜组织中的阳性表达率为15.0%（3/20），两组有显著性差异（P<0.001）；MCL-1 mRNA在OSCC肿瘤组织中的含量高于癌旁正常组织（P<0.05）。结论：MCL-1的高表达在OSCC的发展过程中可能发挥了重要作用。

[关键词]口腔鳞状细胞癌；MCL-1；免疫组织化学；实时荧光定量PCR

[中图分类号]R783 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2014）15-1257-03

The expression of MCL-1 and its significance in oral squamous cells carcinoma

ZHENG Jun1，WU Li-ping1，WANG Tian-ting2

（1.Department of Stomatology，The First Affiliated Hospital，School of Medicine，Shihezi University Shihezi 832000， Xinjiang，China；2.Department of Stomatology， Hami Hongxing Hospital）

Abstract： Objective To explore the expression of MCL-1 and its significance in oral squamous cell carcinoma（OSCC）. Methods The expression of MCL-1 protein was detected using immunohistochemistry， and the MCL-1 mRNA was assayed by real-time fluorescent quantitative PCR. Results 52 of 84 samples（61.9%）in OSCC tissues were found to over-express MCL-1 protein，while 3 of 20 samples（15.0%）in oral normal mucosa tissues were found to over-express MCL-1 protein. Statistical differences（P<0.001）existed between these two groups. The expression of MCL-1 mRNA in OSCC was higher than in OSCC adjacent normal tissues （P<0.05）. Conclusion The high expression of MCL-1 in OSCC has played an important role in the development of OSCC.

Key words：OSCC；MCL-1； Immunohistochenistry；real-time fluorescent quantitative PCR

髓细胞白血病-1（myeloid cell lekemia-1，MCL-1）基因是抗凋亡基因BCL-2家族成员，其在细胞的生长和分化过程中是一个必要的抗凋亡因子，调节其表达的信号传导通路中的任何一个环节出现调节紊乱都会引起MCL-1的过度表达，从而导致包括肿瘤在内人类一些疾病的发生。MCL-1过表达可引起在人类的造血系统的肿瘤以及多种实体瘤[1]，MCL-1蛋白表达下调可促进肿瘤细胞的凋亡，提示MCL-1是人类多种肿瘤的潜在治疗靶点[2]。MCL-1在多种癌组织中呈高表达，而在癌旁组织中呈低表达状态[3]，在OSCC中，MCL-1的表达情况尚未见报道。本实验拟对MCL-1在OSCC和口腔正常黏膜组织中的表达水平进行检测，探讨MCL-1基因在OSCC发展中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 组织标本：收集经我院口腔颌面外科于1993～2011年手术切除的口腔鳞状细胞癌患者石蜡包埋标本84例，其中舌癌38例，颊癌22例，牙龈癌16例，口底癌8例。所选择的标本为术前均未行放化疗、无其他合并肿瘤，术后经病理诊断明确的病例。男性患者57例，女性患者27例；汉族77例，少数民族7例；高分化44例，中分化33例，低分化7例；淋巴结转移30例，无淋巴结转移54例；临床分期：Ⅰ期30例，Ⅱ期26例，Ⅲ期14例，Ⅳ14例。同时收集经HE染色确诊的口腔正常黏膜组织标本20例，所有标本常规福尔马林液固定后石蜡包埋、切片备用。另收集了12例OSCC患者的肿瘤及相应的瘤旁5cm以外组织（病理均确认为正常组织），临床分期为Ⅰ～Ⅲ期，均切成1.0cm×0.8cm×0.5cm的小块，分别包于锡箔纸中，标记好并冻存于液氮中备用。

1.1.2 试剂：Trizol 试剂购自Invitrogen 公司， 逆转录试剂盒Imprim-ⅡTM（A3800）购自Promega公司，Real time SYBR GreenⅠPCR Master Mix购自TOYOBO公司，所需引物由上海生工生物有限公司合成，目的基因MCL-1的引物序列：5′-AGACGATGTGAAATCG- 3′和 5′-TAACTAGCCAGTCC CG-3′。内参基因GAPDH的引物序列：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′和 5′-ATGGTGGTGAA GACGCCAGT- 3′。多克隆兔抗人MCL-1（S-19）抗体（SC-819，稀释度为1：100）购自美国santa cruz公司，抗体稀释液购自福州迈新生物技术开发公司，Envision 免疫组化试剂、DAB显色剂购自丹麦DAKO公司。

1.2 方法

1.2.1免疫组化和结果判定：采用免疫组化Envision法染色，将制好的组织切片，经二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水后行免疫组化染色。抗原采用微波修复，余步骤按试剂盒说明书进行操作。DAB 显色，苏木素复染，中性树胶封固，显微镜下观察。分别用肝癌MCL-1阳性片作阳性对照，用口腔正常黏膜组织标本作阴性对照，用PBS代替一抗作空白对照。结果判定标准：MCL-1阳性细胞为胞浆着色，呈棕黄色颗粒，随机选取10 个高倍视野，结合着色范围及强度进行分级。着色范围以阳性细胞百分率判定：<5%为0分；6%～25%为1分；26%～50%为2分；51%～75%为3分；76%～100%为4分。着色强度根据阳性细胞核着色深浅判定：无着色为0分；浅棕黄色为1分；棕黄色为2分；棕褐色为3分。上述两项相加为评分标准：阴性（-）：0 分；弱阳性（+）：2～3 分；中度阳性（++）：4～5 分；强阳性（+++ ）：6～7 分。

1.2.2 总RNA提取与单链cDNA合成：从液氮中取出组织块，迅速碾碎后采用Trizol抽提法提取总RNA。抽提出的RNA经紫外分光光度计测定OD260和0D280，以确定其浓度和纯度，根据1 OD260= 40μg/ml计算核酸浓度。反应体系：总RNA 1μg，0.5 g/μl Random primer 1μl，0.5 g/μl Oligo（dT）1μl ，DEPC水补至5μl后75℃水浴5min，冰上5min，短暂离心，加入以下试剂，10mM dNTP Mix 1μl，5×Reaction Buffer 4μl，Rnasin Ribonuclease Inhibitor 0.5l，Reverse Transcriptase 1μl，25mM MgCl2 3.5μl，Nuclease- free H2O补至20μl后25℃，5min；42℃，60min；72℃，15min；煮沸5min；立即置冰上5min，-20℃放置待PCR 反应。

1.2.3实时荧光定量PCR：选用Sybr Green Ⅰ为荧光指示剂，应用Cepheid公司smart Cycler

仪对各种mRNA起始拷贝进行分析， 每1份cDNA 标本分两管进行PCR 扩增， 一管扩增目的基因MCL-1， 另一管扩增内参基因GAPDH。反应体系含cDNA 1μl，5uM Forward Primer 1μl，5uM Reverse Primer 1μl，2×SYBR Green Real-Time PCR Master Mix

2 结果

2.1 MCL-1蛋白在OSCC和口腔正常黏膜组织中的表达：免疫组化结果显示，MCL-1蛋白阳性着色定位于胞浆，呈淡黄、棕黄或棕褐色。在OSCC组织中，MCL-1蛋白弥漫分布于胞浆中，染色强度为中等～强着色（如图1A），阳性表达率为61.9%（52/84），呈高表达。在口腔正常黏膜组织中，MCL-1蛋白表达水平较低，弱着色或不着色（如图1B），阳性表达率为15.0%（3/20），呈低表达。MCL-1在OSCC组织中的表达明显高于口腔正常黏膜组织（χ2=14.263，P<0.001）。

2.2MCL-1 mRNA含量在OSCC患者肿瘤和癌旁正常组织中的差异：根据耙基因MCL-1和内参基因GAPDH的标准曲线用公式Y=101/△CT，计算GAPDH和MCL-1的Y值近似相同约为2，表示两者CT值减少1个循环对应的模板DNA的增加倍数为2倍。根据上述结果可以应用简化公式2-△△C（t）来计算。按上述公式计算结果为：12例OSCC肿瘤组织中MCL-1基因的mRNA表达的最低值为7.80×10-2，最高值为9.77×10-1（4.02±3.35×10-1）；而12例OSCC癌旁正常组织中的mRNA表达的最低值为1.26×10-2，最高值为1.82×10-1（7.42±6.25×10-2）。经配对t检验，OSCC肿瘤组织中MCL-1 mRNA表达高于癌旁正常组织，差异有统计学意义（t=3.162， P=0.020）。

3 讨论

MCL-1基因是B细胞淋巴瘤基因-2家族中的一员，定位于人染色体1q21， 编码蛋白分子量为42KD，含有350个氨基酸。其在许多正常组织中广泛表达[4]，主要在上皮组织、淋巴组织的生发中心细胞、神经内分泌细胞等人类正常组织中表达，并已有研究表明在胃癌[5]、肝癌[6]白血病[7]、肺癌[8]、胰腺癌等[9]肿瘤中高表达。MCL-1的亚细胞定位与细胞生长状态密切相关[10]，在呈指数幂生长的细胞中，MCL-1 主要位于线粒体；在静止期细胞中，MCL-1主要位于细胞核。本研究发现OSCC组织MCL-1主要以胞浆表达为主，表明OSCC细胞处于快速增殖期，符合OSCC的肿瘤生物学特性。MCL-1 表达上调提示了肿瘤的发生，超过85%的转MCL-1 基因小鼠在两年内发生了B 细胞淋巴瘤[11]。本实验中发现MCL-1在84例OSCC组织中阳性表达率61.9%，正常口腔黏膜组织中阳性表达率15.0%，MCL-1 蛋白在OSCC中的表达高于正常口腔黏膜组织（P<0.001），并且MCL-1 mRNA在OSCC肿瘤组织中的含量也高于癌旁正常组织（P<0.05）。这表明MCL-1高表达与OSCC发生发展有关，可作为OSCC早期预警的重要指征。

总之，在正常组织以及肿瘤组织中MCL-1作为一个重要的存活因子，在细胞内的表达受多种机制的调节。人们对MCL-1的功能和调节的研究取得了重要的突破。随着对MCL-1的进一步研究和新技术的应用，MCL-1有望为恶性肿瘤的诊断和基因治疗提供新的靶点。

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[收稿日期]2014-05-20 [修回日期]2014-06-15

编辑/何志斌