新西兰兔肌注肉毒毒素后肌肉及神经组织超微结构的变化研究

陈俊男等

[摘要]目的：观察新西兰兔注射肉毒毒素后，局部肌肉及神经组织超微结构变化特点，为把A 型肉毒毒素充分利用于临床实践提供重要的组织形态学依据及指导依据。方法：选雄性新西兰白兔32只，随机分为A组和B组，每组各16只。选择耳前肌为注射部位，右侧耳前肌注射0.05ml（2.5U）注射用 A 型肉毒毒素，其中A组注射新鲜配置好的A型肉毒毒素，B组注射配置后储存2 周的A型肉毒毒素；左侧耳前肌注射等量生理盐水作为对照。A、B组各随机分为2组，每组8只，分别于注射后第5天和第12周进行其肌肉组织活检，对照侧同时间点取活检。行肌肉、神经组织电镜观察。结果：肌肉电镜观察结果：在注射后早期（第 5天），新鲜及储存的A型肉毒毒素对肌肉的影响无显著性差异；在注射后晚期（第12周），新鲜及储存的A型肉毒毒素比较，两者造成的肌肉萎缩程度无显著性差异。神经电镜观察结果：A型肉毒毒素注射后神经改变与上述肌肉改变同。结论：通过电镜观察注射A型肉毒毒素后的局部肌肉、神经，可以理想地观察单个目的肌肉及神经的超微结构变化特点，并且发现储存2周的A型肉毒毒素与新鲜的A型肉毒毒素比较，两者效价基本相同，为A型肉毒毒素在临床开展相关研究及应用提供了新的思路。

[关键词]A型肉毒毒素；超微结构；变性；电镜

[中图分类号]R62 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2014）17-1445-04

Changes of ultrastructure of muscle and nerve in New Zealand white rabbits after injected with botulinum toxin

CHEN Jun-nan1，LI Zhi-hua1，LV Xiao-jie1，HU Xiao-chun1，WANG Yi1，LV Chuan2，SONG Jian-xing2，TIAN Xiao-chen1

（1.Department of Plastic，General Hospital of Second Artillery of PLA，Beijing 100088，China；2.Department of Plastic Surgery，Changhai Hospital，The Second Military Medical University of PLA， Shanghai 200433，China）

Abstract： Objective To observe the ultrastructural changes of muscle and nerve of New Zealand White Rabbits after injected with botulinum toxin in order to provide scientific base of histomorphology for clinical use of botulinum toxin type A. Methods Totally 32 male New Zealand White rabbits were randomized divided into group A（16） and group B（16），and anterior auricular muscle was used for injections. Each right anterior auricular muscle received the injection of 2.5U BTXA， Group A received the injection of freshly reconstituted BTXA while group B received the injection of stored （for 2 weeks）BTXA， and left anterior auricular muscle of the same rabbit with the same amount of saline as controls.Group A（16） were randomized divided into two groups which included 8 rabbits each.Group B（16） were randomized divided into two groups which included 8 rabbits each.Muscles and motor nerves were harvested at 5 days （early period） and 12 weeks （late period） respectively after BTXA injection， and left anterior auricular muscle was separated for histological analysis.Alterations in muscle and nerve ultrastructure were evaluated with electron microscopy. Results Degeneration findings in muscle after botulinum toxin injection revealed no significant difference between freshly reconstituted and stored toxin in the early period（the fifth day）.When stored （for 2 weeks） toxin was used， atrophic changes in the muscle were the same as the fresh toxin at 12 weeks.On nerve evaluation， the changes on nerve ultrastructure shows similar degeneration as the muscle. Conclusion Injecting Botulinum toxin type A into local muscle and evaluated with electron microscopy is a reasonable way to evaluate alterations in destination muscle and nerve ultrastructure.It seems that stored BTXA for 2 weeks and freshly reconstituted BTXA has the same initial potency，and it provides a new study and treatment for clinical research.

Key words：botulinum toxin A； ultrastructure； degeneration； electron microscopy

A型肉毒毒素（Botulinum Toxin A，BTXA）作为一种神经毒素，可选择性地作用于周围运动神经末梢，抑制乙酰胆碱的释放、融合和停靠，产生化学去神经作用，导致肌肉松弛麻痹[1-2]。A 型肉毒毒素用于面部美容除皱始于20世纪90年代初。由于独特的除皱功效，目前注射用A型肉毒毒素（BTXA） 在国内已成为较为广泛应用的面部美容生物制品，应用越来越广泛[3]。A 型肉毒毒素制造商建议：根据制品特性，应将A 型肉毒毒素储存于 -20℃～-5℃冰箱，生理盐水配置后宜在4h内使用，否则会影响其效价[4-7]。由于小剂量A 型肉毒毒素即可产生巨大效应，如此会有相当一部分A 型肉毒毒素剩余，造成制剂的浪费，处理不当更会污染环境。国外已有研究机构对新鲜和储存A 型肉毒毒素效价进行了对照研究，但针对肌注肉毒毒素神经、肌肉组织超微结构变化的研究鲜有报道。因此，本实验针对这方面在动物身上进行实验，研究新鲜和储存A 型肉毒毒素对运动神经和神经支配肌肉的超微结构的影响，以期为今后临床应用提供可靠依据。

1 材料和方法

1.1材料：实验动物：新西兰白兔32只，普通型，健康，雄性，体重1.5～2kg，由上海第二军医大学实验动物中心提供。实验试剂：A型肉毒毒素由兰州生物制品研究所研制，商品名为“衡力”，冻干结晶肉毒毒素，规格为100U/瓶，该制剂临床应用广泛，安全性及有效性较高[8]；75%乙醇等化学试剂均购自上海长海医院。实验器材：LKB-Ⅱ超薄切片机，瑞士制造；日立 H800 透射电子显微镜，日本制造。

1.2动物模型制备和分组：新西兰白兔32只，实验前两周购入，单笼喂养，混合饮食，动物饲养于SPF级环境下进食消毒颗粒饲料，饮消毒水，室温（23±0）℃，湿度56%，12h/12h间隔照明，定期紫外线消毒与排风。实验过程中对动物处置符合2006年科学技术部发布的关于善待实验动物的指导性意见[9]。平均体重为1.80kg。术前常规禁食。本实验动物被随机分成A组（16只）和B组（16只），各组动物均取右耳注射A型肉毒毒素，左侧耳前肌注射等量生理盐水作为对照。每安瓿A型肉毒毒素含 100U，使用前用生理盐水 2ml 稀释配置成50U/ml。配好制剂即刻注射，剩余储存于 4℃冷藏箱内，储存时间为2周。选择新西兰白兔右耳耳前肌为注射部位，耳前肌的起始处附着于同侧额骨，距离内眦约 2cm，止于同侧耳腹内侧肌缘（距耳基底3cm左右），其最小安全剂量为2.5U[10]。A组局部注射新鲜配置好的A型肉毒毒素0.05ml（2.5U）， B组注射配置后储存2周的A型肉毒毒素0.05ml（2.5U）。A、B组各随机分为2组，每组8只，分别于注射后第5天和第12周进行其肌肉组织活检，对照侧同时间点取活检。行肌肉、神经组织电镜观察。

1.3组织活检：每组左侧耳前肌作为自身对照组（G0），A组随机分为2组，每组8只（设为G1、G2），分别于注射后第5天和第12周进行其肌肉组织活检，B组随机分为2组，每组8只（设为G3 、G4），分别于注射后第5天和第12周进行其肌肉组织活检，对照组同时间点取活检。耳前肌活检采用纵行切口，钝性分离，垂直切断取出。取下的耳前肌及神经均置于4%多聚甲醛固定4h以上；后将组织用磷酸缓冲液（PBS）0.1mol/L漂洗；锇酸1%固定2h后用PBS漂洗；梯度（30%、50%、70%、90%及100%）丙酮脱水；用环氧树脂包埋、聚合等；LKB-Ⅱ超薄切片机切片，最后行日立H800透射电子显微镜观察。

1.4神经、肌肉组织学观察：分别观察实验组和对照组的神经、肌肉标本。主要观察指标：肌肉萎缩指标包括A-I带溶解/消失、Z线溶解/消失、细胞核迁移、肌原纤维溶解和肌纤维变性等[13]。神经的华勒（氏）变性指标包括髓鞘松散/溶解、Schwann细胞浆变性、轴索松散/溶解、无髓神经松散/溶解和基质变性等。上述样本采用半定量评分系统[11]评估变性的数量和程度。未观察到任何变性计0分；观察到明显的变性计5分。

1.4统计学处理：对电镜观察结果采用χ2检验（ Kruskal-Wallis Test）进行统计学处理，P<0.05为差异有显著性意义。

2 结果

2.1肌肉组织学观察结果：①每组左侧耳前肌作为自身对照，对照组（G0）耳前肌肌肉结构正常，无变性表现（P>0.05）；②A组新鲜的肉毒毒素注射早期组（G1）与对照组比较表现为明显的肌肉变性（P<0.001）；③A组新鲜肉毒毒素注射晚期组（G2）与对照组比较表现为明显的肌肉变性（P<0.001）；④B组储存2周的肉毒毒素注射早期组（G3）与对照组比较表现为明显的肌肉变性（P=0.001）；⑤B组储存2周的肉毒毒素注射晚期组（G4）与对照组比较表现为明显的肌肉变性（P=0.003）；⑥A组新鲜的肉毒毒素注射早期组（G1）同B组储存2周的肉毒毒素注射早期组（G3）比较，二者肌肉变性程度无显著差别（P=0.142）；⑦A组新鲜肉毒毒素注射晚期组（G2）和B组储存2周的肉毒毒素注射晚期组（G4）比较，电镜观察的超微结构变化结果同上（P=0.621）。肌肉变性标准评分见表1。

2.2神经组织学观察结果：①每组左侧耳前肌作为自身对照，对照侧的耳前肌神经结构正常，无变性表现（P>0.05）；②A组新鲜的肉毒毒素注射早期组（G1）与对照组比较表现为明显的神经变性（P<0.001）；③A组新鲜肉毒毒素注射晚期组（G2）与对照组比较表现为明显的神经变性（P=0.003）④B组储存2周的肉毒毒素注射早期组（G3）与对照组比较表现为明显的神经变性（P=0.001）；⑤B组储存2周的肉毒毒素注射晚期组（G4）与对照组比较表现为明显的神经变性（P=0.003）；⑥A组新鲜的肉毒毒素注射早期组（G1）同B组储存2周的肉毒毒素注射早期组（G3）比较，二者神经变性程度无显著差别（P=0.070）；⑦A组新鲜肉毒毒素注射晚期组（G2）和B组储存2周的肉毒毒素注射晚期组（G4）比较，电镜观察的超微结构变化结果同上（P=0.477）。神经变性标准评分见表2。

3 讨论

肉毒毒素制造商建议：配置后A型肉毒毒素（BTXA）使用时间宜控制在4h内，原因是神经毒素的活性会随时间延长而下降。这项用药指南让很多注射医生面临两难抉择：一方面由于小剂量的BTXA即可产生巨大效应，如此会有相当一部分 BTXA 剩余，造成制剂的浪费，处理不当更会污染环境；另一方面，因为4h内使用这一狭窄的时间范围，医生需要花费很多心思来安排足够多的患者在这个时限内完成注射，但往往事与愿违。所以国内、外已有不少临床医生采取将未用完的A型肉毒毒素存储起来以备后续使用。本实验对储存BTXA的相关效价展开对比研究，以期指导肉毒毒素在临床上的应用。

国外已有关于肉毒毒素临床应用观察的实验研究，证实了储存一定时间的BTXA，其生物学活性未受明显影响。Garcia 和 Fulton[12]研究将新鲜配好的 BTXA与储存时间依次为 1、2和4周的BTXA 对比，通过物理检查等方法主观评价BTXA 治疗的患者，得出了新鲜与储存BTXA在效价上无明显差别的结论。1997 年，Sloop等[13]也做过类似实验，实验对象为 8例患者的指 （趾） 短伸肌，行肌电图描记结果，得出新鲜与储存 2周的BTXA 的效价无显著性差异的结论。Jabor等[14]用新西兰白兔模型来比较新鲜和储存BTXA的效价。此项实验将新鲜BTXA与分别储存了 2、6、12 周的 BTXA 比较，采用电生理学等实验方法，得出新鲜和储存的BTXA原始效价相同的结论。近年来，Thomas and Siupsinskiene[15]进行了肉毒毒素治疗43例喉肌痉挛患者的实验研究，他们得出结论：平均储存时间约为2.4周的肉毒毒素，其效价同新鲜肉毒毒素相比无显著性差异。

本实验动物被随机分成A组（16只）和B组（16只），各组动物均取右耳注射，左侧耳前肌注射等量生理盐水作为对照。并通过超微电镜观察实验得出：储存2周的BTXA与新鲜BTXA比较，二者对神经、肌肉变性的影响基本相同。

那么，配置好的A型肉毒毒素必须要在4h才时间窗口期内使用吗？本实验证实：储存的BTXA与新鲜的BTXA比较，二者均能导致肌肉、神经变性，且变性情况无明显差别。这一实验得出结论：储存一定时间的A型肉毒毒素，其效价未受影响，且无副反应发生。关于肉毒毒素的临床实验国外已有研究。国内临床实验鲜有开展，且关于肉毒毒素储存后药品成分变化，应进行生化实验等进一步研究。

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[收稿日期]2014-07-20 [修回日期]2014-08-20

编辑/何志斌