一种改进的自体表皮细胞悬液制取方法

赵洪良 赵连魁 李冬军 郑文立 杨高松 李明

[摘要]目的：探讨新的自体表皮细胞悬液制取方法。方法：选取30只大鼠，应用切削皮法结合胰蛋白酶和组织微粒法结合中性蛋白酶/胰蛋白酶法两种技术获得自体表皮细胞悬液并进行细胞产量和活力的比较。结果 实验组整个操作约1h内即可完成，而对照组则需要1.5天的时间。实验组活细胞率0.966±0.35，对照组活细胞率0.971±0.42，两组间比较无明显差异（P>0.05）。细胞产量：实验组（1.5±0.52）×106，对照组（1.9±0.72）×106，两组间比较有无差异（P>0.05）。结论：切削皮法结合胰蛋白酶法制取表皮细胞悬液，制取的表皮细胞悬液的产量和活力与组织微粒法结合中性蛋白酶/胰蛋白酶法比较无显著差异，但操作简单和耗时少。

[关键词]表皮细胞；悬液；细胞活力； 胰蛋白酶

[中图分类号]R62 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2014）19-1615-03

自体皮片移植是皮肤创面修复的重要手段，供皮区的瘢痕、感染和色素异常并发症的难题一直未得到解决，尤其大面积深度烧伤患者因为供皮区域限制等问题，促进了自体表皮细胞悬液的出现，并开始应用于创面治疗，但是临床应用效果不佳[1]。1975年培养自体表皮细胞成功[2]，由于培养的自体表皮细胞不但需要2周左右实验室培养时间，而且需要昂贵的实验室和技术熟练的专业人员，最重要的是经过培养的表皮细胞成功移植后存在组织脆弱，抗感染能力差等问题，所有这些缺陷限制了其临床应用[3-4]。因此开发一种技术简单，耗时少、产量高和活力好的自体表皮细胞悬液制取方法是烧伤和整形外科的研究热点。本研究对切削皮结合胰蛋白酶法和组织微粒结合中性蛋白酶/胰蛋白酶法两种技术获得自体表皮细胞悬液进行了比较，为临床应用奠定基础。

1 材料和方法

1.1动物与分组：选取成年健康 Wistar 大鼠 30 只，体重200～300g，雌雄各半，术前禁食6h，予以10%水合氯醛（0.3ml/100g）腹腔注射麻醉（供皮区选择正常的背部两侧皮肤，固定好大鼠，消毒后，刮除背部鼠毛，形成约2cm×2cm无毛区，周围用胶带粘贴。用碘伏常规消毒正常皮肤3次，设计切取皮片范围1.0cm×1.0cm，皮下注射生理盐水使供皮区皮肤明显肿胀并形成一个相对的平面，取无菌一次性剃须刀片，中号直血管钳夹刀片，切下表皮，取皮片的厚度在切削时应密切观察。或者辊轴取皮刀切取刃厚皮片，取下的皮片立即放于生理盐水浸洗3遍备用，供皮创面，无菌凡士林油纱覆盖，无菌敷料加压包扎。

1.2酶消化：实验组：无菌条件下，将浸洗后皮片放入无菌容器中，组织剪简单剪碎皮片至1.0mm×1.0mm，加入适量无菌0.125%胰蛋白酶/0.01%EDTA溶液，37℃消化20min后，无菌条件下离心收集上层表皮细胞悬液。对照组采用，无菌皮片浸于Dipase I 溶液，4℃消化过夜，镊子分离表皮细胞，生理盐水漂洗3遍，0.25%胰蛋白酶和 0.01% EDTA混合液，37℃消化10min，吸管反复吹打分散细胞，收集表皮细胞悬液[5]。

1.3细胞活力测定：细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液以9：1混合混匀。在3min内，分别计数活细胞和死细胞。OlympusIX71倒置显微镜镜下观察，死细胞被染成明显的蓝色，而活细胞拒染呈无色透明状。血球计数板法进行细胞计数，并统计细胞活力：活细胞率（%）= 活细胞总数/（活细胞总数+死细胞总数）×100%。

1.4统计学方法：采用SPSS16.0 统计软件进行分析，两组设计的计量资料采用t检验，计数资料用百分率表示，率的比较采用 χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1无菌条件下，实验组整个操作约1h内即可完成，而对照组则需要1.5天的时间，所获得的表皮细胞悬液中均含有表皮细胞，黑色素细胞和朗罕氏细胞。

2.2细胞活力：实验组活细胞率0.966±0.35，对照组活细胞率0.971±0.42， 两组间比较无明显差异（P>0.05，如图1）。

4.3 细胞产量：实验组（1.5±0.52）×106，对照组（1.9±0.72）×106，两组间比较有无差异（P>0.05，如图2）。

3 讨论

表皮细胞悬液不仅可用于创面治疗，而且应用于白癜风等皮肤疾病的治疗，因此制取表皮细胞悬液的方法相关研究是烧伤和整形外科研究热点之一。综合文献报道的制取方法，目前主要步骤包括：取皮，剪碎，酶消化和获得表皮细胞悬液[4-6]。

首先，取皮方法主要有负压取皮，剃须刀切削法取皮，辊轴刀或者电动取皮刀取皮，手术刀切取全厚皮等。负压取皮法尽管损伤小，但是操作复杂，耗时长，并且移植后表皮细胞总成活率低，是因为负压吸疱对表皮角质形成细胞和黑素细胞的生理功能造成了一定的影响，影响了移植后细胞的存活[7]。至于手术刀切取全厚皮，损伤重以及不适合大面积取皮等缺点而限制了其的应用。而应用切削法直接切下薄层表皮，表皮细胞的各种生理功能并未受到影响，而且操作时间短。故本研究中采用该方法顺利取得皮肤标本，但操作过程中都要注意掌握深度，表皮移植术后应尽量减少运动，以免影响表皮细胞的成活。

其次，酶消化技术。中性蛋白酶结合胰蛋白酶二步法是获得培养表皮细胞实验室常用的方法，该方法需要在特定的细胞培养间首先用中性蛋白酶分离表皮和真皮，这个过程需要一个较长的时间，然后用胰蛋白酶消化表皮后即可得到表皮细胞悬液。该方法对实验室的设备和人员要求较高，操作步骤复杂，耗时长，在临床应用受到很大的限制，此外，该产品价格昂贵限制了临床应用。

Recell技术是近年来出现的新方法之一[8]，该方法是消化表皮真皮连接区的真皮面的表皮细胞制取悬液应用于临床，仅仅只获取了标本中一部分有活性的细胞成分，制取表皮细胞悬液，浪费了较多的皮肤标本，本研究改进了表皮细胞悬液的制取方法，利用组织剪制成组织微粒的简单步骤使胰蛋白酶与皮肤微粒结合更充分，更加有利于表皮细胞的分离。这个过程中掌握消化的时间至关重要，消化时间过长则影响表皮细胞活性，时间过短则表皮细胞不能充分游离。

最后， 表皮细胞悬液的产量和活力。经过本方法消化的表皮细胞悬液中细胞的产量与中性蛋白酶结合胰蛋白酶法的表皮细胞产量比较无明显统计学差异，而且两组活细胞率比较无明显差异。此外，本方法耗时少，方法简单，无菌手术间即可完成操作，这提高了临床应用的前景。

综上所述，切削皮法结合胰蛋白酶法制取表皮细胞悬液，制取的表皮细胞悬液的产量和活力与中性蛋白酶/胰蛋白酶法比较无显著差异，但技术简单，容易操作，耗时少，因此具有良好应用前景。

[参考文献]

[1]Billingham RE，Reynolds J. Transplantation studies on sheets of pure epidermal epithelium and on epidermal cell suspensions [J].Br J Plast Surg，1952，5：25-36.

[2]Rheinwald JG，Green H.Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes：the formation of keratinizing colonies from single cells[J].Cell，1975 ，6（3）：331-343.

[3]Woodley DT，Peterson HD，Herzog SR，et al. Burn wounds resurfaced by cultured epidermal autografts show abnormal reconstitution of anchoring fibrils[J]. JAMA，1988，17：2566-2571.

[4]Wood FM，Kolybaba ML，Allen P.The use of cultured epithelial autograft in the treatment of major burn wounds：Eleven years of clinical experience [J].Burns，2006，32： 538-544.

[5]吴昌炎，房志强，江宝华，等.自体表皮细胞悬液在修复皮肤组织缺损创面中的作用研究[J].中国美容医学，2012，21（12）：2201-2203.

[6]张大维，树瑜.白癜风西医治疗的研究进展[J].中国美容医学，2009，18（5）：730-733.

[7]李金勇，董爱丽，郭丙辰.自体表皮移植治疗白癜风供皮区两种取皮方法的比较[J].中国麻风皮肤病杂志，2008，24（10）：798-799.

[8]Wood FM，Giles N，Stevenson A，et al. Characterisation of the cell suspension harvested from the dermal epidermal junction using a ReCell kit [J].Burns，2012， 38：44-51.

[收稿日期]2014-07-31 [修回日期]2014-08-26

编辑/何志斌