傣药咪多领（云南琵琶甲）抑制兔耳瘢痕增生的实验研究

赵文斌 李娅 赵川等

[摘要]目的：观察傣药咪多领（云南琵琶甲）提取物制剂对兔耳增生性瘢痕组织的影响。方法：建立兔耳增生性瘢痕动物模型，术后28天将模型随机分为实验组、阳性药物（康瑞保）对照组和空白对照组，分别外用琵琶甲制剂、康瑞保或生理盐水，4周后观察各组瘢痕形态、瘢痕增生指数（HI）、成纤维细胞数量、胶原密度及转化生长因子TGF-β1的表达。结果：实验组、康瑞保对照组瘢痕增生指数（HI）均较空白对照组低，差异有显著性意义（P<0.05）。实验组、康瑞保对照组成纤维细胞数量和胶原密度与空白对照组比较均减少或降低，差异有统计学意义（P<0.05）。实验组、康瑞保对照组转化生长因子TGF-β1表达与空白对照组比较均减少（P<0.05）。结论：傣药咪多领（云南琵琶甲）可抑制兔耳瘢痕增生。

[关键词]琵琶甲；增生性瘢痕；动物模型

[中途分类号]R62 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2014）19-1611-04

皮肤受到创伤、炎症刺激后，组织内有过量的成纤维细胞增殖和胶原沉积，以致失去正常皮肤的形态而形成瘢痕。目前，瘢痕的防治仍然是临床上的难题之一。本研究利用兔耳增生性瘢痕模型观察傣药咪多领（云南琵琶甲）制剂对瘢痕组织的作用，为该药防治瘢痕提供初步理论依据。

1 材料和方法

1.1实验药物：云南琵琶甲提取物制剂由云南省中医医院制剂中心提供，采用甲醇热回流并正己烷萃取的方法制备，浓度为0.3g/ml生药。康瑞保（复方肝素钠尿囊素凝胶），由德国麦氏大药厂提供。

1.2实验动物及器材：成年健康大耳白兔12只，体重2.5～3.0kg，雌雄各半。由昆明医科大学动物实验中心提供并饲养，适应性喂养48h后实验。自动石蜡包埋机（Leitz公司，德国），全自动脱水机（Sakura公司，日本），石蜡切片机（Leitz公司，德国），光学显微镜及照相系统（Olympus公司，日本），电热恒温烤箱（上海医疗设备厂）等。TGF-β1一抗、SABC试剂盒（武汉博士德公司），通用型SP检测试剂盒、DAB试剂盒（北京中杉金桥公司）。

1.3实验方法

1.3.1建立动物模型：先用氯胺酮20mg/kg进行兔背肌注，麻醉成功后碘伏液消毒兔耳皮肤。然后在兔双侧耳腹侧分别做6个直径为lcm、间距2cm的园形创面，完整切除全层皮肤，直至软骨膜表面，并完整切除软骨膜。无菌纱布压迫止血后涂擦红霉素眼膏，创面暴露。

1.3.2动物模型分组、给药及处理：创面上皮化后（术后28天）将12只兔的144个创面随机分为3组，即琵琶甲提取物制剂实验组、阳性药物（康瑞保）对照组和空白对照组，每组共有48个创面。实验组、康瑞保对照组从术后28天开始给药，分别于瘢痕局部外涂云南琵琶甲提取物、康瑞保，每次0.5ml/瘢痕，涂药后用敷料封包，使药物充分发挥作用，空白对照组外涂生理盐水，3次/天。给药4周后在同样麻醉下切取瘢痕组织标本，切片观察。组织学观察：标本用体积分数10%甲醛缓释液固定，脱水，石蜡固定包埋，切片，厚度5μm，切片后苏木精-伊红染色，在显微镜下观察。免疫组织化学观察：瘢痕组织石蜡包埋、切片，厚度4μm，二甲苯及梯度乙醇脱蜡至水，3%双氧水灭活内源性过氧化物酶，柠檬酸缓冲液中高压修复抗原，5%山羊血清封闭20min ，加入1：100倍稀释TGF-β1一抗，4℃过夜，再滴加生物素化二抗37℃孵育20min，SABC工作液37℃处理20min，DAB溶液显色，苏木精复染，1%盐酸乙醇溶液分化，饱和碳酸锂溶液返兰，脱水透明后封片观察。

1.4观察指标：①大体观察：在给药前（术后28天）、给药4周后（术后56天），分别记录兔耳瘢痕大小、颜色、质地及瘢痕厚度；②瘢痕增生指数（HI）：HE染色组织切片于低倍镜下用测微尺测量，按公式m=A/B计算瘢痕增生指数。A=瘢痕凸起最高点至耳软骨表面的垂直高度；B=瘢痕周边正常皮肤皮缘至耳软骨表面的垂直高度；③每张组织切片分别随机选5个不重叠视野进行图像观察，定量检测成纤维细胞数量和胶原密度；④转化生长因子TGF-β1检测：给药4周，切取瘢痕组织，免疫组化法观察各组标本表达情况。

1.5统计学处理：数据均以均数±标准差（x±s）表示，采用SPSS13.0统计软件进行数据处理。对指标进行单因素方差分析和t检验，P<0.05有统计学差异。

2 结果

2.1瘢痕形成情况：创面伤口约7天后逐渐愈合，14～20天创面完全上皮化。给药前（术后28天）见高出皮面的增生块，淡红色，触之较软。给药4周后（术后56天）空白对照组增生块较硬，充血明显呈暗红色，范围不超过原创沿，厚度约为兔耳腹面皮肤厚度的3倍左右，多数瘢痕中心出现乳头状突起；实验组、康瑞保对照组瘢痕稍高出皮面，淡红色，触之较软，有皱褶（如图1）。

2.2 瘢痕增生指数情况：给药4周实验组、康瑞保对照组和空白对照组HI分别为（2.10±0.32）、（2.01±0.29）和（3.31±0.45）。经统计学分析，治疗组与康瑞保对照组之间HI差异无显著性意义（P>0.05）；治疗组、康瑞保对照组与空白对照组之间HI差异有显著性意义（P<0.05），见表1。

2.3组织切片观察：给药4周时，空白对照组真皮层明显变厚，为周边正常真皮层厚度的3～4倍，主要是大量成纤维细胞增殖，胶原纤维增多、增粗，致密并排列紊乱，其间有少量炎性细胞，结构近似人的增生性瘢痕组织。治疗组、康瑞保对照组真皮层厚度约为正常真皮层厚度的2倍，成纤维细胞数量较少，胶原纤维密度下降明显，表层排列稍规则，成水平向，内层排列紊乱（如图2）。治疗组、康瑞保对照组成纤维细胞数量和胶原密度与空白对照组比较均减少或降低，差异明显（P<0.05），见表2。免疫组织化学检测结果：TGF-β1阳性信号为棕黄色颗粒，主要表达在表皮的基底层细胞和真皮附属器的上皮细胞、血管内皮细胞和真皮深层的成纤维细胞胞浆及细胞表面。实验组、康瑞保对照组TGF-β1呈弱阳性，空白对照组TGF-β1表达较强（如图3）。实验组、康瑞保对照组转化生长因子TGF-β1表达与空白对照组比较均减少（P<0.05），实验组与康瑞保对照组TGF-β1表达无明显差异（P>0.05），见表3。

3 讨论

皮肤创伤的愈合过程是以瘢痕形成的形式来完成的，瘢痕是创伤修复的必然产物，凡深达真皮层的伤口几乎都以瘢痕愈合而告终[1]。瘢痕从病理学上可分为正常瘢痕和病理性瘢痕，以病理性瘢痕最多见，主要包括增生性瘢痕和瘢痕疙瘩。病理性瘢痕是由皮肤纤维母细胞增殖及凋亡平衡失调所致的一种良性疾病[2]。瘢痕组织中基质成分主要是胶原纤维，其中又以Ⅰ型胶原纤维居多。正常情况下，伤口内的胶原合成与分解呈动态平衡，在某些情况下，这种平衡被打破，导致成纤维、肌纤维母细胞合成胶原增多，而胶原纤维分解减少，胶原合成速度远大于胶原分解，最终导致了胶原沉积形成瘢痕组织。目前研究证实发生机制可能是由微循环、免疫、基因表达、细胞增殖和凋亡、胶原代谢和排列、细胞因子等多种因素共同作用的结果[3-4]。近年来，TGF-β被认为与创伤愈合、瘢痕形成及多种纤维化性疾病关系最具代表性的细胞因子之一[5-6]。

目前，瘢痕的治疗方法主要有手术切除、类固醇激素、抗代谢药、免疫抑制剂、放射疗法和硅胶膜等[7]，外科手术的局部复发率高达80%[8]，在外科术后辅以加压、激光治疗等方法可降低局部复发率，但其复发率仍在50%以上[9]。放射治疗是目前外科手术后降低瘢痕复发的有效方法，但其复发率大约在20%左右[10]。上述方法因易复发或严重的全身性副作用而限制了临床应用，因此从祖国中医中药及民族药中筛选出疗效确切、副作用小的防治瘢痕的有效药物，具有重要的临床意义。

祖国医学对瘢痕的治疗有着悠久的历史，有关瘢痕的病机认识，一般认为本病与先天禀赋，素体特异有关，加之遭受金创，水火之伤，余毒未尽，气滞血瘀，搏结经络而成[11]。治疗上多采用活血化瘀、攻毒散结、通络止痛、酸涩收敛之品。喙尾琵琶甲（云南琵琶甲）是云南民间长期使用的一种药用昆虫，具有抗菌、消炎、解毒、调节机体免疫功能、提高抗病能力的作用，《西双版纳傣药志》、《中华本草》傣药卷记载，该虫傣药名“咪多领”，功效为清热解毒、软坚散结、消肿止痛、熄风定惊，可内服亦可外用。笔者在临床试用该虫制剂治疗增生性瘢痕收到较好的疗效，用药后瘢痕明显萎缩变软，痛痒症状消失或明显减轻，证明其“清火解毒、软坚散结、消肿止痛”的功效。

本研究采用兔耳增生性瘢痕的动物模型实验观察云南琵琶甲制剂对兔耳增生性瘢痕的作用，观察其对瘢痕组织形态学的影响。我们参照文献[12-13]制作了兔耳增生性瘢痕模型，结果显示大体形态学变化、组织学变化以及成纤维细胞密度与瘢痕增生指数变化符合文献报道，表明动物模型复制成功。本实验结果表明云南琵琶甲制剂对兔耳瘢痕组织增生有明显的抑制作用，表现为与对照组相比实验组真皮层厚度、瘢痕增生指数较小，成纤维细胞数目明显减少，胶原纤维致密下降，排列较规则，转化生长因子TGF-β1表达明显减少。云南琵琶甲制剂防治瘢痕具有安全、有效、价格低廉的优点，将有广阔的前景，其具体有效成分及作用机制有待进一步深入研究。

[参考文献]

[1]Li-TsangCW，LauJC，ChanCC.Prevalence of hypertrophic scar formation and its characteristics among the Chinese population[J].Burns，2005，31（5）：610.

[2]LuoS，Benathan M，Raffoul W，et al.Abnormal balance between proliferation and apoptotic cell death in fibroblasts derived from keloid lesions[J].Plast Reconstr Surg， 2001，107（1）：87-96.

[3]谢有富，陈辉，黎庆梅，等.增生性瘢痕水泡液转化生长因子的变化及意义[J].中华医学美学美容杂志，2010，16（3）：195-197.

[4]曾维惠，王倩倩，覃静净，等.ALA-PDT对兔耳增生性瘢痕抑制效应及作用机制的初步研究[J].中国美容医学，2011，20（11）：83-86.

[5]徐少骏，滕建英，谢菁，等.曲安奈德、干扰素a-2b和维拉帕米治疗增殖瘢痕的作用机制比较[J].中华整形外科杂志，2009，25（1）：37-40.

[6]Rhett JM，Ghatnekar GS，Palatinus JA，et a1.Novel therapies for scar reduction and regenerative healing of skin wounds[J].Trends Biotechnol，2008，26（4）：173-180.

[7]Kelemen O，Kollár L.Current methods of treatment and prevention of pathologic scars[J].Magy Seb，2007，60（2）：63-70.

[8]Cosman B，Crikelar GF，Ju DMC，et al.The surgical treatment of keloids[J].Plast Reconstr Surg，1961，27（4）：335-358.

[9]Apfelberg DB，Maser MR，white DN，et al.Failure of carbon dioxide laser excision of keloids[J].Lasers Surg Med，1989，9（4）：382-388.

[10]Kovalic JJ，Perez CA.Radiation therapy following keliodectomy；A 20 year experience[J].Int J Radiat Oncol Biol phys，1989，17（1）：77-80.

[11]杨思澍，张树生，傅景华.中医临床大全[M].北京：科技出版社，1991：926.

[12]李荟元，刘建波，夏炜，等.增生性瘢痕动物实验模型的建立与应用[J].中华整形外科杂志，2001，17（5）：275.

[13]冯登超，杨喜明，薛宏斌，等.建立更加稳定和有效的兔耳瘢痕模型[J].中国美容医学，2009，18（2）：191-194.

[收稿日期]2014-07-25 [修回日期]2014-08-31

编辑/何志斌