应用光动力治疗瘢痕疙瘩的实验研究

孔祥明等

[摘要]目的：应用瘢痕疙瘩动物模型探索瘢痕疙瘩的有效治疗方法。方法：用临床患者的瘢痕疙瘩组织构建裸鼠的瘢痕疙瘩动物模型，对动物模型进行光动力试验治疗前并对动物模型治疗前、后瘢痕组织的变化进行观察分析。结果：构建的裸鼠动物模型基本保持瘢痕疙瘩的结构特征，光动力治疗后瘢痕组织变小，成纤维细胞减少，胶原纤维减少。结论：光动力疗法治疗瘢痕疙瘩有效。

[关键词]瘢痕疙瘩；光动力；动物模型

[中图分类号]R62 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2014）20-1704-03

Application of photodynamic experimental research for the treatment of keloid

KONG Xiang-ming，ZHANG Ming-li，CHEN Nan，CHEN Yun-gui，LIN Ling，KE Jin-cheng，ZHUANG Ya-yan

（Dermatology，The Second Affiliated Hospital of Xiamen of Xiamen Medical College，Xiamen 361021，Fujian，China）

Abstract： Objective Explore a effective method to keloid by using animal model of naked mice with keloids. Methods clinical patients with keloid tissue construct keloid animal model of nude mice，the animal models tested photodynamic therapy，and animal model of treatment before and after the change the scar tissue observation analysis. Results The fibroblasts in specimens remained the capability of synthesizing and secreting collagen，the keloid after photodynamic therapy has shrunk，fibroblasts and collagen decreased. Conclusion This procedure showed that it is feasible and reliable to use nude mice as the model of the animal with keloids， photodynamic therapy to treat keloid is effective.

Key words：keloid；PDT；model of animel

瘢痕疙瘩是皮肤伤口或不明原因所致皮损病理性愈合后形成的异常瘢痕组织。由于其发病机制不明确，所以临床尚没有一种疗效可靠且安全的方法。尽管近年来多种方法的综合应用使得瘢痕疙瘩的疗效有所提高，但目前尚无一种满意的治疗方法[1]。本课题组利用5-氨基酮戊酸富集于异常增生组织的特性应用光动力方法对瘢痕疙瘩动物模型进行试验治疗研究。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1实验动物：雌性裸鼠 50只，鼠龄6～8周，由厦门大学实验动物中心提供。动物存放在预先消毒的微隔离器里，再置于隔离室的层流通风窗内。裸鼠5鼠1笼放置，消毒、专用饲料和水喂养。

1.1.2病例：男，25岁。13年前无明显诱因前胸部出现红色斑丘疹，已有逐渐增大至20mm×40mm红色光滑斑块，术后病理检查证实为瘢痕疙瘩（未作任何治疗）。

1.1.3实验试剂：5-氨基-4-酮戊酸盐酸盐粉118mg/瓶（一种光敏剂），由上海复旦张江生物医药股份有限公司生产。

1.1.4LED-IB光动力治疗仪：由武汉亚格光电技术有限公司生产。

1.2实验方法

1.2.1动物模型的构建： 雌性裸鼠50只，分A组和B组，A组30只，分为6个小组，每组5只；B组20只，分为4个小组，每组5只，分笼饲养。将手术切除瘢痕组织迅速置于无菌容器的生理盐水中，再放入装有冰的保温桶中，立即转移到动物实验室，全部操作在瘢痕离体后2h内完成。所有操作均在无菌条件下进行，裸鼠用1 %戊巴比妥钠按60mg/kg作腹腔内注射麻醉。在裸鼠背部左右两侧用75%酒精消毒，于两肩胛骨处各作一0.5cm切口，潜行分离形成皮下腔隙，瘢痕组织切成约5mm×5mm×5mm大小，植入皮下腔隙中，切口用5-0无损伤缝线缝合。伤口涂酒精后裸露，术后不用任何抗生素。移植后裸鼠转入各自笼内饲养后，每天观察，植入术后 4、8、12、16 周分批处死 30 只实验裸鼠，每批 4 只，取出其背部的 2块植入物，每块切成 3部分，分别作苏木精-伊红染色法（hematoxylin-eosin staining，HE染色）和电镜观察术后切取组织时进行观察，观察以下指标：胶原纤维形态、密度以及细胞成分， 血管形成情况以及有无变性坏死、炎性细胞浸润等现象。

1.2.2 瘢痕疙瘩动物模型的实验治疗：首先，配制成浓度为20%的溶液，临用前加入专用凝胶（118mg/瓶加入0.5ml），药液必须新鲜配制，保存时间不超过4h。然后，清洁患处并保持干燥后，将配制的20%盐酸氨酮戊酸将光敏剂配置成20%凝胶涂于事先固定裸鼠瘢痕疙瘩上的特制边框内，再用胶带固定，放回饲养笼内避光2h。取出涂药的裸鼠，除去固定于瘢痕疙瘩表面的胶带等物品，将四肢固定于试验平板上，将其置于波长为（630±5）nm的光动力治疗机下距离10cm，能量密度100Mw/cm2，照射20min。照射后放回饲养笼内观察，在照射后1、3、6周分别选取治疗后不同反应者，取其移植物进行组织病理及电镜检查。

2 结果

2.1.1治疗前大体观察：实验裸鼠术后全部成活，后切口无感染，完成实验。移植后约4周，移植物周围出现开始外观似肉芽组织的粉色组织，推动移植物上的皮肤时皮下移植物与皮肤同时移动，移植物表面可见小血管，体积缓慢增大，此后移植物体积保持不变，至移植后16周移植物仍清晰可见。

2.1.2治疗前组织学观察

2.1.2.1光学显微镜观察 移植后第4周，取出2只处死，切除的移植物H-E染色（如图 1）可见被染成蓝色成纤维细胞呈梭形，周围有条状的胶原纤维，从第4周到第16 周（如图 2）成纤维细胞逐渐增多，胶原纤维增多，增粗呈板状或旋涡状排列，局部胶原逐步融合呈玻璃样变。

2.1.2.2电镜观察：瘢痕组织移植至裸鼠皮下后第4 周， 透射电镜下见较多成纤维细胞，细胞核染质分部均匀，内质网脱颗粒，线粒体轻度肿胀，并可见一定量胶原纤维和血管（如图3）。至移植后第8 周，透射电镜下见成纤维细胞增多，细胞核染质分部均匀， 内质网多扩张脱颗粒，胶原纤维增多，并可见弹力膜（如图4），在移植后第12周时电镜下除成纤维细胞核染质分部均匀， 内质网多扩张脱颗粒，胶原纤维多外，仍可见弹力膜（如图5），在移植后16周电镜发现成纤维细胞减少，细胞核染色质边集，线粒体出现空泡，内质网扩张脱颗粒，胶原纤维多，可见细胞膜有断裂 （如图6）。

2.2.1治疗后大体观察：光动力治疗后第2天开始出现轻度红斑、水疱，1周开始糜烂、渗出减少、结痂，有2只反应较轻者结痂脱落，表皮下移植物无明显变化；其余18只反应较重，糜烂及溃疡结痂时间长痂皮后，12只3周后结痂先后脱落，表皮下移植物略缩小；6只4周后脱落，表皮下移植物缩小较明显。

2.2.2电镜观察：经光动力治疗后一周取结痂脱落者1只处死，切除的移植物透射电镜下所见，与同期（移植后5周）未处理者无明显区别（如图7）；经光动力治疗后3周，透射电镜下较同期未处理裸鼠移植物相比见较多成纤维细胞，细胞核染质分部均匀，内质网脱颗粒，线粒体轻度肿胀，并可见一定量胶原纤维和血管（如图8） 。经光动力治疗后9周（移植后第12 周）， 透射电镜下见成纤维细胞减少，核染质分部均匀，内质网扩张脱颗粒，胶原纤维少，线粒体轻度肿胀空泡（如图9）。

3 讨论

目前，瘢痕疙瘩的治疗方法很多，药物注射治疗包括糖皮质激素、博来霉素、5-氟尿嘧啶等[2-6]，以及手术、放疗、冷冻、激光等疗法[7-11]，存在或疗效差，或副反应大，易复发等缺点，采用二联或三联，甚至四联进行综合治疗，可取得定有一定效果[12-14]，但远没有达到满意程度。瘢痕疙瘩具有超过原受损范围非限制性增生，具有一定的肿瘤生长特性[15]，因此治疗比较困难。

光动力治疗是通过特定波长的光源激发生物组织中的光敏物质，引发一系列物理、化学和生物学过程。其原理是局部应用光敏剂后，光敏剂可以选择性地富集于异常增生组织的特性通过波长为（630±5）nm的光源照射，产生单线态氧，继而达到治疗目的[16]。本课题组利用5-氨基-4-酮戊酸盐酸盐（光敏剂）富集异常增生组织（瘢痕组织）的特性，对构建的瘢痕疙瘩动物模型进行实验治疗并进行分析。应用临床上经病理证实的瘢痕疙瘩患者的瘢痕组织移植于裸鼠肩背部皮下后，经过观察及组织病理发现人体瘢痕组织在裸鼠体内在一定时期内可保持瘢痕疙瘩的结构和特性，说明所构建裸鼠的瘢痕疙瘩动物模型基本符合瘢痕疙瘩动物模型要求。光动力治疗瘢痕疙瘩裸鼠的试验发现，经光动力治疗后裸鼠治疗部位相继出现水疱糜烂、渗出减少、结痂，结痂脱落，表皮下移植物逐渐缩小，此现象在组织病理得到了验证。光动力治疗后反应轻者（仅出现轻度红斑，无明显水疱）病理上与同时段未进行处理的动物模型相比较变化不明显；光动力治疗后反应明显者（出现明显水泡、糜烂、溃疡）治疗后不同时段的移植物透射电镜下所见，与同期未进行处理者相比较有明显区别。经光动力治疗后3周，透射电镜下较同期未处理裸鼠移植物相比初期见较多成纤维细胞，细胞核染质分部均匀，内质网脱颗粒，线粒体轻度肿胀，并可见一定量胶原纤维和血管，并可见炎性细胞浸润，可能与治疗刺激有关；光动力治疗后期结果显示， 透射电镜下见成纤维细胞减少，胶原纤维少，推测与光化学反应使得纤维细胞死亡，胶原减少，达到治疗瘢痕疙瘩目的。在本课题的进行过程中，发现一些问题，由于目前未见有关光动力疗瘢痕疙瘩方面的报告，本课题中进行光动力所采用的光敏剂的剂量及治疗参数均参考了人类治疗肿瘤的计量和参数，对实验结果可能会照成一定影响，不过对于目前临床上的顽疾—瘢痕疙瘩在治疗上的探索具有一定的意义。

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[收稿日期]2014-07-25 [修回日期]2014-08-27

编辑/何志斌