水曲柳DNA浓度及滴加时间对杨树花粉管通道法结实率的影响

杜人杰　曲跃军　金虎　陶双勇　邹威　王庆斌　周冬跃　张翼　付静　时平

摘要[目的]对适宜的水曲柳DNA浓度及滴加时间进行初步探索，获得具有水曲柳优势性状的杨树植株。[方法]通过花粉管通道法，将携带水曲柳基因组的DNA导入杨树。人工授粉后一定时间在花柱基部进行横切，把不同浓度DNA溶液滴加到子房切口端，10 d后统计结实率。[结果]在同一时间点，随着水曲柳DNA浓度的增加，结实率呈现逐渐降低趋势；随着授粉与滴加DNA时间的延长，同一浓度下呈现出结实率先降低后升高趋势。当水曲柳DNA溶液滴加时间控制在人工授粉后6 h左右，DNA浓度为50 μg/ml时是在杨树上运用花粉管通道法转化水曲柳基因最适宜的条件，结实率可达17%。[结论] 滴加时间与外源DNA不同梯度水平对转化结实率有很大影响。

关键词水曲柳；花粉管通道；杨树；结实率

中图分类号S792.12文献标识码A文章编号0517-6611（2014）22-07323-02

水曲柳材质优良，耐寒性良好，是珍贵的用材树种。杨树是营造短轮伐期工业原料速生丰产林和城乡绿化的主要树种，杨树早期速生、无性繁殖容易，可迅速种植形成人工林，解决木材问题，但品种老化及生产力低一直是制约杨树商品林生产力发展的瓶颈之一，现代转基因技术为改良杨树性状提供了有效途径。花粉管通道法导入外源DNA的技术，由周光宇等（1983）建立并在长期科学研究中得以发展。花粉管通道法的主要原理是授粉后使外源DNA能沿着花粉管渗入，经过珠心通道进入胚囊，转化尚不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞[1]。该方法具有操作简便经济、育种时间短等优点，已在植物基因转化中初见成效，如棉花、水稻、大豆等作物[1]，目前在杨树应用上只有陈洪伟等（2008）通过花粉管通道导入外源胡杨DNA到白杨中的研究，其他应用尚未见报道。笔者利用花粉管通道法将外源水曲柳DNA导入杨树，对适宜的水曲柳DNA浓度及滴加时间进行初步探索，为获得具有水曲柳优势性状的杨树植株，冲破物种之间的界限，实现物种间的基因传递，为后续的杨树良种选育研究提供技术支持。

1材料与方法

1.1材料转基因受体：黑龙江牡丹江青梅试验站栽植的22年生中牡1号杨（P.deltoides×P.cathayana）的F1代；供体：牡丹江北山栽植的20年生水曲柳（Fraxinus mandshurica Rupr.）。

1.2方法

1.2.1水曲柳DNA的提取。采用大连宝生物公司《植物基因组DNA纯化试剂盒（9768）》提取水曲柳DNA，OD260/OD280为1.8～2.0，水曲柳DNA用去离子水溶解。

1.2.2水曲柳DNA的导入。 采集中牡1号杨的雄枝，实验室水培，挑选饱满的花药，收集花粉，室温晾干，装入干燥瓶放入4 ℃冰箱备用。

选择发育良好、当天初开的中牡1号杨雌花，进行人工授粉，授粉后3～24 h在花柱基部进行横切。在装有50～400 μg/ml 水曲柳DNA1 000 μl的离心管中，加入1 μl TWEEN20。用移液器吸取混合后的DNA液在子房切面上进行滴加，滴加10 d后，统计结实率。DNA浓度分别为50、100、200、400 μg/ml，每个处理滴加100个花序；对照DNA浓度为0 μg/ml（已加1 μl TWEEN20），同样处理100个花序。滴加时间分别为授粉后3、6、12、24 h；每个水平作3次重复。