利用优化的SSR分子标记技术检测杂交水稻万优481纯度

黄成志　雷树凡　胡景涛　吕直文　黄文章　严明建　冉彦秀

摘要[目的]通过降低试验药剂、减少PCR循环时间、提高琼脂糖利用指数等，建立经济、快速、低污染的杂交水稻纯度鉴定体系。[方法]将杂交水稻万优481、亲本万3A和万恢481在光照培养箱内温度发芽（30 ℃，长到5 cm左右），用CTAB法提取DNA；按优化的PCR体系和电泳方法，用亲本万3A和万恢481的DNA从24对引物中筛选出多态性好的引物P18，用引物P18对杂交水稻万优481样本进行纯度鉴定。[结果]利用优化的SSR分子标记技术准确鉴定出万优481的纯度为98.5%，与田间鉴定结果相符，凝胶电泳成像带谱清晰，同时，与常用方法相比，酶等试验药品使用量减少20%～25%，试验所用时间较常用方法减少了50%以上。[结论]利用优化的SSR分子标记技术体系鉴定杂交水稻种子纯度，经济、快速且鉴定的结果清晰、可靠，同时大大减少琼脂糖等试验残渣的产生，降低了对环境污染，值得推广、应用。

关键词SSR分子标记；杂交水稻；纯度

中图分类号S188文献标识码A文章编号0517-6611（2014）22-07321-02

纯度是杂交水稻种子质量的核心指标，是种子质量分级的主要标准，是企业购销种子的关键依据。准确、快速鉴定杂交水稻种子的纯度意义重大。然而，过去的田间鉴定需要大量的时间（至少90 d左右），随着DNA分子标记的兴起，利用DNA分子标记鉴定种子纯度大大减少了试验时间，但用常用的PCR扩增程序，做一板样品（96个样）仍需要2.5 h左右，凝胶电泳（96个样）也需要1.5 h以上，并不能完全满足目前高效的需要。SSR（Simple sequence repeats，简单序列重复）标记亦称微卫星（Microsatellite）标记，已被广泛用于各物种种群划分、杂种优势预测和农作物育种等领域[1-6]。随着农作物杂交种的广泛推广，SSR分子标记已被广泛用于水稻、玉米等杂交种子纯度鉴定[7-10]。由于杂交水稻种子的广泛应用，市场上的品种数目繁多，种子纯度鉴定工作量大、鉴定成本较高，笔者拟在常用SSR分子标记技术的基础上，对试验耗材用量和PCR等过程进一步优化，以达到节约成本、节省时间的效果，探索一套快速、低耗的SSR分子标记技术鉴定体系，为杂交水稻种子纯度鉴定提供快捷、可靠、低投入、少污染的方法。

1材料与方法

1.1试验材料重庆三峡农业科学院自制自繁种杂交水稻万优481及亲本万3A和万恢481。

1.2试验方法

1.2.1DNA提取。将杂交水稻万优481（500粒）、亲本万3A（20粒）和万恢481（20粒）在光照培养箱内30 ℃下发芽至5 cm左右，然后用CTAB法提取DNA。

1.2.2PCR反应体系、反应程序及电泳方法的优化设计。PCR反应体系：20 ml体系包括dNTP 1.6 ml、PCR buffer2.0 ml、引物2.0 ml、模板DNA2.0 ml、Taq酶0.15 ml、水12.25 ml。

PCR反应程序： 94 ℃预变性5 min；94 ℃15 s，55 ℃15 s，72 ℃15 s，35个循环； 72 ℃ 3 min。

电泳方法优化：36孔子4排（24孔梳子4排），2次点样检测288个样（一次点样96个样）。

1.2.3筛选引物。利用亲本万3A、万恢481的DNA从24对引物中筛选出多态性好的引物P18，供试验使用。

1.2.4万优481纯度鉴定。利用筛选出来的引物P18对万优481群体经过PCR、琼脂糖凝胶电泳、成像，最后读带、统计，并计算出该批种子的纯度。

2结果与分析

2.1纯度鉴定结果用优化的SSR分子标记技术，对500株万恢481植株苗进行纯度鉴定，经读带统计，该批种子纯度为98.5%，与田间鉴定结果相符。

2.2优化的SSR分子标记技术试验效果利用优化的SSR分子标记技术进行引物筛选和纯度鉴定，最后成像带谱均较为清晰（图1），能够清楚地读出带谱，完全可以满足杂交水稻种子纯度鉴定工作。图1优化后的电泳成像效果2.3PCR耗材及效率分析在试验耗材方面，优化后的PCR体系较常用体系节省了20%的dNTP、20%的PCR buffer和25%的Taq酶，大幅降低了试验成本。

在试验用时上，利用优化后的反应程序扩增一板PCR只需要60 min，而常用反应程序扩增一板PCR则需要150 min左右，即利用优化后的PCR反应程序可以大大减少试验时间，提高了工作效率。

2.4电泳效率及琼脂糖利用指数分析传统的电泳方法，一次制胶只能做96个样品，用时90 min左右，折合1.07个/min样品，而优化后，一次制胶可以做出288个样品，用时130 min，折合2.22个/min样品，优化后的电泳效率为常用方法2倍多。同时大大减少制胶次数，节省了制胶所用成本。