鱼源特定腐败菌及其应用研究进展

章志超 桂萌 李平兰

摘 要：特定腐败菌（specific spoilage organisms，SSOs）是影响鱼肉腐败的重要因素之一。不同条件下鱼源SSOs不同，本文重点就SSOs的确定，即鱼源优势腐败菌筛选及其腐败能力分析的研究现状进行概述。在此基础上，对鱼源SSOs生长预测，靶向控制以延长鱼类鲜品货架期等应用研究进行了总结，旨在说明鱼源SSOs的研究价值，并对SSOs未来研究方向进行了展望。

关键词：鱼；特定腐败菌；分类；确定；预测；控制

Advances in Specific Spoilage Organisms in Fish and Their Applications

ZHANG Zhi-chao， GUI Meng， LI Ping-lan*

（College of Food Science and Nutritional Engineering， China Agricultural University， Beijing 100083， China）

Abstract： Specific spoilage organisms （SSOs） are one of important factors affecting fish spoilage， which vary under different conditions. This article focuses on the current status of research on the screening and spoilage abilities of predominant SSOs in fish. In addition， we summarize recent research on growth prediction of SSOs in fish and their targeted control for extending the shelf life of fish products. From this review， we know that SSOs in fish are worth studying. Furthermore， we discuss future research trends in this area.

Key words： fish； specific spoilage organisms （SSOs）； classification； confirmation； prediction； control

中图分类号：TS254.4 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2014）03-0025-06

目前我国消费者倾向于购买活鱼，但活鱼销售不仅增加了运输成本，且会带来大量的城市生鲜垃圾，不利于渔业整体发展[1]。因此采用便于销售的小包装形式处理鲜鱼，使产品直接进入超市货架具有重要意义。但鱼肉营养丰富，水含量高等特性使其容易腐败，同时Gram等[2-3]研究发现：在贮藏过程中逐渐占据优势地位并产生腐败代谢产物，最终导致肉品腐败的腐败能力强的特定腐败菌（specific spoilage organisms，SSOs）是促使鱼肉腐败的最重要原因之一，因此对SSOs确定，并进行靶向抑制将是研究鱼肉保鲜的重点。由于不同条件下鱼体微生物分布不同，本文对鱼类产品在不同条件下的SSOs分类，重点就鱼源优势腐败菌筛选及其腐败能力分析，以确定SSOs的研究现状进行了分析，最后就SSOs生长预测，靶向控制以延长鱼类产品货架期等应用研究进行了总结，为了解SSOs的腐败特性及鱼类产品品质控制提供参考。

1 特定腐败菌

由于各种微生物对所处环境适应能力不同，因此鱼类的栖息环境和加工流通条件等差异会影响鱼体的微生态系统，使鱼类贮藏过程中的SSOs种类或数量发生变化[4]。

1.1 不同栖息环境的影响

鱼体所含的细菌主要来源于水中，大多数为需氧型细菌。它们的初始菌相受品种、外界环境影响，其中鱼类栖息水域的温度和盐度是影响菌相组成的主要因素[5-6]。Svanevik等[7]对鱼体分布的微生物进行了总结：来源寒带、温带干净水域的鱼体主要携带的是革兰氏阴性嗜冷菌，包括一些好氧菌及兼性厌氧菌；而热带水域菌群与温带水域相似，但鱼体嗜温菌比例较高。同时已有研究表明：有氧冷藏温、热带水域淡水鱼的SSOs为假单胞菌属（Pseudomonas sp.），有氧冰藏海水鱼的SSOs为腐败希瓦氏菌（Shewanella putrefacens）[8]；Gillespie等[9]在研究澳大利亚和非洲等热带水域捕获的鱼类时发现微球菌属（Micrococcus sp.）也是优势腐败菌之一。同时即使同一种鱼，鱼体微生物分布会因捕获地域、时间的不同而有所差异。le Nguyen等[10]对越南不同地区的5个农场，不同季节（雨季、旱季）的鲶鱼鳃、肠道和表皮菌群多样性分析表明：不同地区、时间及取样部位的不同，鲶鱼的优势菌群也有特异性差异，该研究认为这与饲喂方法、水源、pH值等有关，这为鲶鱼的可溯源性提供了参考。

1.2 不同加工工艺、流通条件的影响

鱼肉极易腐败，货架期短，因此往往通过物理、化学手段或添加剂处理等方法改进贮藏工艺，但这会导致鱼肉微生物分布发生极大变化。蓝蔚青等[11]研究发现有氧冷藏带鱼的SSOs是希瓦氏菌（Shewanella sp.）与荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens），但用壳聚糖、茶多酚和溶菌酶等配制的复合保鲜剂处理后，SSOs受到明显抑制。此外，为控制鱼肉腐败，不同包装形式下的SSOs也是研究重点之一。大量研究表明，在有氧包装中，假单胞菌、希瓦氏菌是鱼肉贮藏中的SSOs；而真空包装和气调包装抑制了好氧菌的生长，兼性厌氧菌如乳酸菌、热杀索丝菌（Brochothrix thermosphacta）等则占聚生长优势，发光磷杆菌（Photobacterium phosphoreum）则常是气调包装中的SSOs[12-17]。

不同流通条件同样会对鱼体微生物分布产生重要影响。Svanevik等[7]对直接取自围网渔船和从围网渔船转移至冷藏运输箱后的大西洋马鲛鱼的SSOs分析，研究表明：转移放置后菌相发生了改变，优势腐败菌增加。同时贮藏温度在鱼类产品货架期研究中考虑较多，被认为是影响鱼类腐败的最重要因素[18]，主要影响微生物的生长速率，从而导致SSOs的数量发生变化。

虽然不同环境影响使鱼源SSOs的种类或数量有所差异，但在同等加工贮藏条件下，只有一种或几种微生物总是作为SSOs出现（表1）[2]。

表 1 鱼肉在不同加工贮藏条件下常见的SSOs[2，12-15，19]

Table 1 The common SSOs from fish in different processing or

storage conditons[2，12-15，19]

加工方式 贮藏方式 SSOs

鲜鱼 空气，冷藏 假单胞菌（Pseudomonas sp.）、腐败希瓦氏菌

（Shewanella putrefacens）、

气调或真空，冷藏 磷发光杆菌（Photobacterium phosphoreum）、

乳酸菌、热杀索丝菌（Brochothrix thermosphacta）

空气，大于

10～15℃ 假单胞菌、肠科菌（Enterobacteriaceae）、

弧菌（Vibrio sp.）

低盐、略酸化等 真空，冷藏 乳酸菌、发光磷杆菌、嗜冷肠科菌

半保藏（醋渍、腌鱼等） 真空，冷藏 乳酸菌、酵母

温和热处理（巴氏杀菌等） 空气，冷藏 芽孢杆菌属（Bacillus sp.）

干鱼 空气，常温 丝状真菌

熟鱼 空气，常温 假单胞菌、肠科菌（Enterobacteriaceae）

2 特定腐败菌的确定

为了控制鱼肉腐败，延长鱼类产品的货架期，SSOs的确定显得十分重要。根据SSOs的定义，SSOs不仅是腐败终点的生长优势菌株，而且应具备能够产生腐败代谢产物，腐败能力强等特点。因此，对于SSOs的确定必须同时从生长优势菌的筛选及其腐败能力2个方面分析。

2.1 腐败终点优势菌的筛选

监测优势菌的传统方法主要通过选择性培养结合生理生化鉴定进行，但传统方法盲目性大、费时费力，且灵敏度低，鉴定结果非常不稳定[18]。近年来，不依赖于传统培养的检测手段越来越多地应用于食品腐败菌的分析中。这些新型技术具有检测快速、灵敏度高、分析全面等优点，从而使优势菌的筛选更具有针对性。根据相关文献报道，主要可分为PCR依赖型方法和PCR非依赖型方法。这主要包括：特异性PCR、实时定量PCR、细菌基因组重复序列PCR（repetitive extragenic palindromic-PCR，rep-PCR）、变性/温度梯度凝胶电泳法（denaturing/temperature gradient gel electrophoresis，DGGE/TGGE）、脉冲场凝胶电泳（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）、末端限制性片段长度多态性（terminal restriction fragment length polymorphism，T-RFLP）、单链构型多态性（single-strand conformation polymorphism，SSCP）、核糖体DNA扩增片段限制性分析（amplified ribosomal DNA restriction analysis，ARDRA）、核糖体基因间区分析（ribosomal intergenic spacer analysis，RISA）、荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）等[18-20]。这些方法在畜禽产品、水产品的生长优势菌的研究中都各有特点及特定适用范围。近年来关于鱼肉在货架期终点的优势腐败菌分析所采用的方法总结如表2。

表 2 不同方法筛选鱼类腐败优势菌应用举例

Table 2 Different techniques applied for the screening of

predominant spoilage bacteria in fish

研究方法 研究对象 腐败优势菌 参考文献

传统方法 鱼糜：不同

包装，3℃ 发光磷杆菌（Photobacterium phosphoreum）、

乳酸菌、微球菌属（Micrococcus sp.） [21]

鳕鱼：有氧包

装，不同温度 发光磷杆菌（Photobacterium phosphoreum）

（冷藏），希瓦氏菌属（Shewanella sp.）（超冷） [22]

rep-PCR 11种鱼：有氧

包装，冰藏 希瓦氏菌属、发光磷杆菌、热杀

索丝菌（Brochothrix thermosphacta） [12]

罗非鱼：有氧

包装，4℃ 无色杆菌属（Achromobacter sp.）、

希瓦氏菌属、假单胞菌属（Pseudomonas sp.） [17]

PCR-DGGE 带鱼： 有氧

包装，4℃ 腐败希瓦氏菌（Shewanella putrefacens）、

荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens） [19]

大比目鱼：不同

包装，4℃ 假单胞菌属（有氧），希瓦氏菌属、

发光磷杆菌（气调） [23]

PCR-TTGE 大马哈鱼：气调

包装，不同温度 蜂房哈夫尼亚菌（Hafinia alvei）、发光磷杆菌 [14，24]

RFLP 鳕鱼：不同水

域，不同季节 发光磷杆菌、嗜冷杆菌（Psychrobacter）、

拟杆菌属（Bacteroides） [25]

2.2 腐败能力研究

鱼体腐败过程中某些微生物代谢生成硫化物、吲哚、醛类、酯类及低级脂肪酸等各种具有腐臭特征的产物，使鱼肉原有的形态和色泽发生劣变，并产生腐败特征的不良气味和异味[8]。因此对于SSOs的确定，仅通过对腐败优势菌的鉴定远不够，需结合感官、理化等指标对腐败优势菌的腐败能力进行分析[2]。

为确定大马哈鱼气调包装下的SSOs，MAC?等[24]提出了两步分析法，即从气调包装腐败期的大马哈鱼中筛选出的8株潜在腐败菌进行挑战性实验，对微生物指标及感官指标进行比较，筛选出3株腐败能力较强的菌株；进一步将这3株菌单一或混合反接于无菌鱼块中，对感官、微生物及理化指标进行分析后确定一株腐败能力最强的发光磷杆菌为SSOs。不同学者对菌株腐败潜力分析时，有人选择灭菌鱼汁为菌株培养基质[26-27]、有人则选择无菌鱼块[24-28]。灭菌鱼汁用于腐败菌腐败能力的测定具有快速、简便的特点，可在短期内获得大量数据，但难以模拟鱼肉复杂的组织环境；无菌鱼块则更接近腐败菌的生长环境，但操作要求较高[29]。

同时在分析鱼肉鲜度变化时，常采用感官评价、微生物（菌数或微生态等）及常规的理化分析（如pH值、挥发性盐基氮、三甲胺、脂肪氧化及ATP降解等）等方法。国内相关研究大多只是对腐败菌的腐败能力的初步分析，有研究对鱼源腐败菌的腐败能力进行了定性定量分析，在鱼肉感官拒绝点时，将单位腐败菌产生的腐败代谢产物（挥发性盐基氮、三甲胺等）作为定量指标，对淡水鱼（鲤鱼、罗非鱼）和海水鱼（大菱鲆、大黄鱼）的SSOs（假单胞菌、腐败希瓦氏菌）的腐败能力进行分析[28-31]。但更多的研究主要侧重于利用感官、理化及总菌数指标对鱼类在贮藏过程中的鲜度进行简单评价[32-33]。为了进一步了解鱼肉腐败过程中代谢产生的含氮、胺、氨、醇类和含硫等挥发性物质，气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）、气相色谱-嗅觉分析（gas chromatography-olfactometry，GC-O）等技术逐步被用于鱼肉腐败期挥发性化合物的分析[24， 34-36]。根据SSOs腐败特性，部分常见SSOs的腐败特征物质归纳如下：乙酸可作为评价发光磷杆菌作用的大马哈鱼腐败的指标[24]；2，3-庚烷二酮、3-甲基-1-正丁醛、2，3-丁二酮等是热杀索丝菌腐败特征物质；三甲胺、乙酸乙酯和丁醇是液化沙雷氏菌（Serratia liquefaciens）的腐败特征物质；3-甲基-1-正丁醛、2-甲基-1-正丁醛、2，3-丁二酮、乙酸乙酯等是肉梭状杆菌（Carnobacterium maltaromaticum）的腐败特征物质[37]；腐败希瓦氏菌及荧光假单胞菌分别作用的无菌美洲平鲉的腐败特征挥发性物质以含硫化合物为主[38]。此外，利用高效液相色谱对糖酵解等代谢产生的有机酸变化的检测也被证明是评价腐败菌腐败能力的好方法[39]。

因此，在SSOs的确定中，结合鱼源优势腐败菌的腐败能力分析，对于了解不同的SSOs或不同鱼类的腐败特点具有重要意义。

3 特定腐败菌用于鱼肉新鲜度检测研究

3.1 特定腐败菌生长预测模型

虽然细菌菌落总数常常是许多国家制定水产品新鲜度标准的重要依据[40]，但水产品在不同条件下腐败特性会有所差异，因而根据细菌菌落总数评价鲜度往往不够准确。Olafsdottir等[22]研究表明：鱼肉贮藏中，希瓦氏菌、热杀索丝菌等SSOs的数目与鱼肉鲜度的相关性总体高于细菌菌落总数，SSOs是评价鱼肉鲜度更为适宜的指标。因此，建立与食品品质高度关联的SSOs的生长预测模型对简化分析实验，预测剩余货架期具有重要应用价值。

预测微生物模型已广泛应用于食品行业当中。根据模型中变量的不同，微生物预测模型可分为3类：1）一级模型，描述特定条件下微生物数量随时间变化的关系；2）二级模型，反映环境因子（温度、pH值、αw值等）对微生物生长的影响；3）三级模型，即建立在一、二级模型的基础上的计算机共享软件，也称为专家系统[41]。

目前，修正的Gompertz模型、Baranyi模型及Logistic模型是应用较为广泛的一级生长预测模型，其中Baranyi模型主要是在Logistic模型的基础上引入了迟滞期参数获得[42]。Xiong等[43]认为：当一级模型单独使用时，Gompertz模型优于Baranyi模型；但与二级模型联用时，Baranyi模型更好。此外，新型的一级模型——Huang模型近年来也引起人们的关注，当不考虑史前效应等对微生物生长的影响时，Huang模型优于Baranyi模型[44-45]，但在鱼源SSOs的应用中尚未见报道。牛会敏等[46]在建立冷却猪肉中假单胞菌的最适一级模型时认为：0 ℃为Baranyi模型；5 ℃为修正的Gompertz模型；10 ℃为Huang模型，可见贮藏温度影响一级模型的选择。同样温度也是肉品SSOs的二级模型研究中考虑最多的因素。在二级模型中，平方根模型及Arrhenius模型使用最为普遍。郭全友等[47]比较了由平方根方程与Arrhenius方程建立的不同温度对假单胞菌生长动力学影响的数学模型，结果表明，平方根模型对微生物的最大比生长速率、生长延滞期的预测较Arrhenius模型偏差小。Alfaro等[48]对分离至马鲛鱼的SSOs的预测模型分析时，则考虑了温度及CO2浓度对菌生长的影响，并在恒定及波动温度下得到很好地验证。对于此类多因素情况下的模型分析较为复杂，国内的相关文献报道则较少。此外，三级模型的研究仍处于起步阶段，目前Combase是关于食品微生物生长模型的全球最大数据库，但由于微生物生长具体环境模拟的局限性等，三级模型还有待进一步开发与完善。

实际研究中，SSOs生长预测模型生物最重要的价值之一在于可预测产品剩余货架期，进行定量风险评估。通过确定SSOs的最小腐败量，结合一、二级模型可对一定温度范围的产品剩余货架期进行预测。许钟等[49]研究了0～15℃范围的2种波动温度条件下，对有氧贮藏养殖罗非鱼的SSO（假单胞菌）建立了修正的Gompertz模型与平方根模型，剩余货架期预测值与实测值的相对误差分别为5.9%与-9.1%，预测效果较好；陈睿等[50]则利用Baranyi模型和平方根模型建立的2～15℃下真空包装早餐肠的货架期预测模型也能够快速准确的预测产品的货架期。

尽管预测微生物学研究得到极大发展，但在实际应用中仍存在一些局限或争议：1）微生物培养基质的选择，通常经液体培养基或直接选择性培养获得试验数据，虽然操作简便，但没有考虑到食品基质间的组织复杂性和差异性，或忽视了样品初始菌数的差异等因素[12]，因此采用SSOs反接于实际研究食品中建模的更有针对性，模拟效果更好[51]；2）微生物间的相互作用是影响微生物生长的重要因素，因此利用菌落总数建模常见于报道[52]。但在鱼类等贮藏中，只有少数菌参与腐败过程，且研究表明，只有当微生物浓度大于108 CFU/g才有明显的菌间相互作用[8]，建立SSOs的生长预测模型同样具有现实意义；3）在剩余货架期的预测中，对产品的感官拒绝点的判断较为主观，这也使得SSOs的最小腐败量界定存在一定的人为偏差。同时，由于鱼类等在冷链流通中常常面临温度的波动，为提高微生物预测模型的实际应用价值，波动温度下的微生物预测模型也应是研究的重点之一。

3.2 特定腐败菌靶向控制，延长货架期

SSOs是引起鱼类腐败的最主要的因素之一，因此抑制SSOs的生长，延长鱼类产品货架期的研究具有重要的现实意义。目前，对于SSOs的控制，主要通过低温、不同包装及不同直接保鲜处理等方法实现。

3.2.1 低温贮藏

贮藏温度可以影响微生物的生长速率等而被认为是影响肉品腐败的最重要因素[18]，因此鲜鱼等不论采取何种贮藏方式都以低温为基础，主要包括冷冻贮藏、微冻贮藏、冰温贮藏和冰鲜贮藏等。虽然冻藏能够有效地抑制微生物生长，在水产品中应用较多，但冻藏会造成水产品肌肉冷冻变性，持水力下降，风味物质流失严重等问题。因此，温和加工方式不仅能维持产品鲜度，还能有效抑制微生物活动及各种酶的活性，因而成为SSOs靶向控制的研究重点。王庆丽等[53]研究了鲈鱼有氧包装下在微冻（-2 ℃）和冷藏（4 ℃）下的SSOs的变化，结果表明，SSOs都为假单胞菌、腐败希瓦氏菌，但微冻贮藏对SSOs的生长抑制效果更好，能够延缓鲈鱼品质劣变。Liu等[54]在对冰温（-3 ℃）和冷藏（4 ℃）草鱼的货架期研究中也得出类似结果。

3.2.2 不同包装形式

鱼类产品主要通过有氧托盘包装、真空包装和气调包装等形式包装。不同包装下贮藏的鱼源SSOs的种类会有差异，因而可以通过不同包装形式的选用来对SSOs进行靶向抑制。Pantazi等[55]对地中海旗鱼在不同包装下的SSOs及贮藏货架期差异的研究表明：有氧托盘包装的SSOs是假单胞菌、腐败希瓦氏菌，真空包装的SSOs为乳酸菌，气调包装则为发光磷杆菌，同时货架期比较发现：由于不同环境下，SSOs的生长及代谢差异使得气调包装时货架期最长，有氧托盘包装时则腐败最快。国内学者对不同包装的鱼糜的研究也得出了类似结果[21]。但有报道认为：与畜禽肉相比，气调包装气调包装对对鲜鱼的保鲜效果并不好，如CO2用包装虽然抑制了有氧包装时的SSOs（腐败希瓦氏菌和假单胞菌）的生长，但发光磷杆菌成为新的SSOs，保鲜效果并没有得到很好的改善[56]。

3.2.3 不同保鲜处理

采用物理、化学及生物保鲜剂等手段直接对鱼类产品的SSOs控制，延长货架期的研究较多，尤其生物保鲜剂的开发是目前的研究热点之一。施建兵等[57]用化学方法（臭氧水）对鲳鱼块进行处理后，货架期比对照组延长了11 d；裘帅波等[58]则采用生物保鲜剂（0.5 g/L乳酸菌肽）使青占鱼的货架期延长了4～5 d。但实际应用中单一的保鲜处理难以达到理想的保鲜效果，因此栅栏技术在控制鱼源SSOs的应用成为了研究重点。例如Gao等[59]利用生物抗氧化剂（迷迭香）和生物抗菌剂（Nisin）处理鲳参鱼，使其在4 ℃贮藏的货架期较空白延长了6d；蓝蔚青等[11]利用壳聚糖、茶多酚和溶菌酶等配制的复合保鲜剂对带鱼处理后有氧贮藏，对微生物群落结构分析表明：冷藏带鱼中的SSOs希瓦氏菌与荧光假单胞菌受到明显抑制，其对嗜冷杆菌与其他假单胞菌的抑制效果也较显著，处理组的货架期较空白组延长了1倍。

4 展 望

建立严格的SSOs的确定方法并对其进行生长预测，对于了解不同条件下鱼类腐败特性，延长鱼类产品的货架期具有很好的参考价值。目前，我国在SSOs的确定中传统鉴定方法应用较多，SSOs的腐败能力研究还不够深入，微生物预测模型多停留于已有模型的应用。由于原材料和加工流通条件的复杂性，如何在SSOs的生长预测模型的建立时更好地考虑实际环境（波动温度、多环境因子等）及模型的优化同样具有现实意义。同时在未来SSOs的研究中还应注重多方法联用来确定SSOs，深入分析SSOs的腐败机理，开发更有效的SSOs控制新技术。

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