脯氨酸对杉木愈伤组织超低温冷冻保存的影响

姚丹静 曲弈 陈金慧

摘要：为探索脯氨酸在杉木胚性愈伤组织超低温冷冻保存过程中的作用，本试验以继代14 d的杉木愈伤组织为材料，在预处理阶段设置不同浓度的脯氨酸，采用TTC法测定相应的细胞存活率。结果表明：预处理阶段，脯氨酸浓度为05 g·L1时，细胞存活率相对最高。说明了在预处理阶段添加适宜浓度的脯氨酸可提高超低温冷冻保存的存活率。

关键词：脯氨酸；超低温冷冻保存；杉木；胚性愈伤组织

中图分类号：S722.3+7文献标识码：A文章编号：1004-3020（2014）03-0030-03

The Influence of Prolin on Cryopreservation of Callus of Cunninghamia lanceolata

Yao DanjingQu YiChen Jinhui

（College of Forest Resources and Environment，Nanjing Forestry UniversityNanjing210037 ）

Abstract： To explore the role of prolin in the process of cryopreservation of embryogenic callus of Cunninghamia lanceolata，the cell survival of 14 days callus of Cunninghamia lanceolata of subculture was measured by the TTC method with different concentrations of proline in the pretreatment stage.The result showed that： in the pretreatment stage， when the concentration of proline was 0.5 g·L1，the cell survival was relatively the highest.It suggested that adding suitable concentration of proline in the pretreatment stage can improve the survival of cryopreservation.

Key words：prolin；cryopreservation；Cunninghamia lanceolata；embryogenic callus

杉木Cunninghamia lanceolata是我国特有的速生商品材树种，被广泛应用于木材和药用方面。目前利用杉木成熟合子胚能成功实现体胚发生 [1 ]，但是经过长时间的继代培养，体胚发生的能力会逐渐降低直至丧失。将超低温冷冻保存技术和杉木胚性愈伤组织培养技术结合起来，能长期保存植物材料并保证其遗传稳定性，可有效解决杉木胚性愈伤组织体胚发生能力衰退的问题 [2 ]。同时，脯氨酸可以提高植物对低温的耐受性 [3，4 ]，其在稳定生物大分子结构、降低细胞酸性、解除氨毒以及作为能量库调节细胞氧化还原势等方面有着重要作用；另外还能作为植物细胞质内渗透调节物质、降低凝固点，防止细胞脱水 [5 ]。本试验在已研究的杉木胚性愈伤组织超低温冷冻保存技术的基础上，探讨在预处理阶段，不同浓度的脯氨酸对杉木胚性愈伤组织超低温冷冻结果的影响。

1材料与方法

本试验采用玻璃化冷冻法 [6 ]，对杉木胚性愈伤组织进行超低温冷冻保存。

1.1试验材料

本试验利用实验室诱导的胚性愈伤组织为起始材料，对经过14 d继代培养的材料进行超低温冷冻保存试验。

1.2试验方法

本试验在预处理阶段设置不同浓度的脯氨酸，每个浓度设置3组重复，取预培养20 d与复苏阶段的杉木胚性愈伤组织，测定细胞相对存活率。

1.2.1杉木愈伤组织继代培养

杉木胚性愈伤组织在改良的DCR培养基上能实现稳定增殖，具有体胚发生的能力。继代培养基为DCR+VC 10 mg·L1+2，4-D 10 mg·L1+BA 05 mg·L1+KT 05 mg·L1，谷氨酰胺045 g·L1，肌醇01 g·L1，水解酪蛋白05 g·L1，活性炭25 g·L1，水晶洋菜24 g·L1，麦芽糖20 g·L1，pH53。在23 ℃下暗培养，每25 d为1个继代周期。

1.2.2杉木愈伤组织超低温冷冻保存

（1）预培养：杉木胚性愈伤组织在不含激素的DCR固体培养基上进行预培养，23 ℃暗培养21 d。

（2）预处理：杉木胚性愈伤组织在添加05 mol·L1山梨醇的高渗固体培养基上进行预处理，添加不同浓度的脯氨酸（浓度0，05，10，20 g·L1），23 ℃暗培养5 d。

（3）冷冻方法：无菌条件下，将预处理后的杉木胚性愈伤组织放入18 mL冷冻管，每管05～06 g，加入冷冻液（含06 mol·L1山梨醇+10%DMSO的液体培养基），在冰上预冷20 min后吸去冷冻液，再次加入冷冻液，将冷冻管放入程序降温仪以-1 ℃/min 的速率梯度降温至-90 ℃，于液氮中保存，至少2 d以后进行解冻复苏。

（4）解冻与洗涤：将冷冻2 d以上的杉木胚性愈伤组织从液氮罐中取出，置于37 ℃水浴锅中解冻2 min，化冻后即用复苏液（含07 mol·L1山梨醇的液体培养基）洗涤3次。

（5）复苏与再培养：将解冻后的杉木胚性愈伤组织接种到含04 mol·L1山梨醇的固体培养基中，23 ℃暗培养2 d；2 d后，再将其接种到含02 mol·L1山梨醇的固体培养基中，23 ℃暗培养2 d。

（6）细胞生活力的测定：采用TTC法 [7 ]测定细胞存活率。称取100 mg待测材料，加15 mL04%TTC溶液，15 mL磷酸缓冲液（pH7，01 mol·L1），静置于23 ℃暗处。21 h后去上清液，加入5 mL蒸馏水洗涤细胞，重复3次。加入5 mL 95%乙醇，置于60 ℃水浴中30 min，期间轻轻摇动1～2次，静置于室温下至细胞无色。取上清液，在分光光度计485 nm处测吸光值。用相对存活率表示细胞的活力。

细胞相对存活率= 解冻后细胞TTC值未冷冻细胞TTC值×100%

2结果与分析

2.1杉木胚性愈伤组织超低温冷冻保存过程的生长状况

继代14 d的杉木胚性愈伤组织外观呈白色，细胞饱满含水丰富（图1A）；经预培养18 d后，杉木胚性愈伤组织颜色偏黄，略有失水现象（图1B）；预处理4 d，细胞呈黄褐色，高渗透压使愈伤组织出现了明显的失水现象，细胞质浓缩，该状态有利于冷冻（图1C）；高渗复苏3 d的杉木胚性愈伤组织生长缓慢，没有新愈伤组织出现（图1D）；复苏27 d的杉木胚性愈伤组织长出新愈伤组织（图1E）； 冷冻后恢复继代培养的杉木胚性愈伤组织与未经过冷冻处理的杉木胚性愈伤组织相比，含水量较多，刺状结构较少，愈伤组织细胞较为黏稠（图1F）。

图1杉木胚性愈伤组织各阶段的状态

A.继代培养的杉木胚性愈伤组织；B.预培养18 d的杉木胚性愈伤组织；C.预处理4 d的杉木胚性愈伤组织；D.高渗复苏3 d的杉木胚性愈伤组织；E.复苏27 d的杉木胚性愈伤组织；F.恢复继代培养的杉木胚性愈伤组织。

2.2脯氨酸浓度对杉木胚性愈伤组织存活率的影响

取预培养20 d与复苏阶段的杉木胚性愈伤组织，经过处理后，测其在分光光度计485 nm处的吸光值，通过公式计算，将细胞相对存活率绘制成图2。

在预处理阶段，添加不同浓度的脯氨酸对杉木胚性愈伤组织存活率有一定影响。由图2可以看出，当预处理阶段脯氨酸浓度为05 g·L1时，细胞存活率相对最高。

3讨论

目前，许多关于植物愈伤组织的超低温冷冻保存研究都已见报道，但少有人研究脯氨酸对植物愈伤组织超低温冷冻保存的影响。本试验在已研究的杉木胚性愈伤组织的超低温冷冻保存技术的基础上，探讨脯氨酸在其过程中的作用。试验在预处理阶段添加不同浓度的脯氨酸，以探求最适宜的脯氨酸浓度，使得冷冻后存活率更高。试验结果表明：在预处理阶段，脯氨酸浓度为05 g·L1时，细胞存活率相对最高。另外，通过试验可以发现经过预处理的杉木胚性愈伤组织明显失水，细胞质均高度浓缩，该状态有利于超低温冷冻保存，由此可见预处理是促进细胞质浓缩较为关键的一步。

参考文献

[1]席梦利，施季森.杉木成熟合子胚器官发生和体胚发生 [J ].林业科学，2006，42（9）：29-33.

[2 ]苗琦，谷运红，王卫东 等.植物组织培养物的超低温保存 [J ].植物生理学通讯，2005，41（3）：350-354.

[3 ]肖伏娥，胡扬.外源脯氨酸与水稻幼苗的抗寒性 [J ].湖南农学院学报，1988，（2）：2.

[4 ]乔俊鹏，夏鹏云，梅海军 等.脯氨酸，维生素C和CaCl2处理对深山含笑抗寒性的影响 [J ].江西农业学报，2010，22（2）：40-42.

[5 ]王小华，庄南生.脯氨酸与植物抗寒性的研究进展 [J ].中国农学通报，2008，24（11）：398-402.

[6 ]关静，龚承元，崔占峰 等.玻璃化冷冻保存细胞，组织研究进展 [J ].国外医学：生物医学工程分册，2004，27（4）：252-25.

[7 ]简令成，孙德兰，孙龙华.甘蔗愈伤组织超低温保存中一些因素的研究 [J ].植物学报，1987，29（2）：123.

（责任编辑：郑京津）