良渚北城墙考古土遗址表面藻类的分析研究

武发思 汪万福 贺东鹏 徐瑞红 苏伯民

内容摘要：为了探明造成潮湿环境土遗址生物污损的主要藻类类群，给后期生物退化机理的研究和防治体系的构建提供可靠依据，本研究采用现代分子生物学技术，对杭州良渚北城墙考古土遗址表面的藻类进行了检测和分析。结果表明，引起土遗址生物污损的病害藻类共3门5属，主要为蓝藻门念珠藻属类群，硅藻门菱形藻属与褐指藻属类群次之，蓝藻门壳藻属与绿藻门的未鉴定属最少。另外，苔藓植物门藓纲与薄囊藓属相近的类群在部分样品中占绝对优势。光合藻类与苔藓类群组成的不同主要受各采样位点的空间位置和土体含水量的差异所影响。降低考古土遗址附存环境中的光照和渗水可以有效地控制有害光合生物体的滋生蔓延和侵蚀。

关键词：土遗址；藻类；苔藓；克隆文库；群落组成；潮湿环境

中图分类号：K854.39 文献标识码：A 文章编号：1000-4106（2014）04-0114-07

一 引 言

藻类是引起文物病害的常见生物类型，它们对文物的生物退化作用主要表现在美学价值的降低和材料性质的改变两个方面。研究发现，蓝藻和绿藻在石质文物的生物退化过程中扮演着先锋入侵者的角色[1]。藻类细胞增殖及色素积累引起的覆盖通常称为生物污损，而因细胞生物活性作用导致材料分解的过程可称为生物风化[2]。绿藻生物膜的形成促进了材料表面对空气中污染物的捕获能力，导致文物逐渐变黑[3，4]。同时，藻类可分泌大量的胞外聚合物，这种生物质胶体在文化遗产材料孔隙内的收缩与膨胀循环产生的机械力会进一步造成材质结构的破坏[5]。不仅如此，文物表面的沉积物和藻类固定的碳水化合物还可为其他异养微生物提供生长基质，加速材料的退化[6]。石质文物表面深绿色和黑褐色的硬壳状沉积物主要由蓝藻、绿藻、其他微藻、真菌和地衣组成[7，8]。藻类的生长和增殖在很大程度上受制于温度、湿度、光照等环境因子，潮湿环境下建筑材料的变绿程度与其表面温度的变化呈负相关，另外，湿度水平和营养供应对于藻类的生长和增殖也发挥着重要作用[9]。

我国文物资源丰富，历史建筑与考古遗址在中原、南方等地区的潮湿环境中分布广泛。受土体的物质组成、结构构造及其他物理化学性质的影响，土遗址本身就比较脆弱，在潮湿环境下更难以保存。近年来，我国文物保护工作者在潮湿环境土遗址原位加固材料的筛选[10]、“潮湿环境”范围的界定[11，12]、保护理念的探索与技术的研发方面开展了大量卓有成效的工作[13]，为南方地区大型土遗址的保护提供了重要的理论依据和技术支持。

潮湿环境下土遗址病害生物的检测和鉴定至关重要，直接影响到对后期腐蚀退化过程的研究和防治措施的建立。然而，我国在遗产地生物病害的研究领域开展的工作还较少，对于文物病害霉菌、藻类与苔藓的鉴定主要依赖于传统形态学等手段[14]，现代分子生物学检测技术仍未能在病害生物类型的检测中得到广泛应用[15]。本研究以良渚古城北城墙考古土遗址表面的病害藻类为研究对象，旨在建立一种基于分子生物学技术的病害藻类快速检测方法，为准确判定文化遗产地的病害藻类的群落组成提供技术支撑。

二 材料与方法

2.1 取样地简介

良渚遗址位于浙江省杭州市余杭区，年降水量在1150—1550mm之间。根据潮湿状态下的土遗址分类及定量化的参数指标，该遗址地属于典型的湿润区潮湿环境与潮湿状态下的土遗址[11]。

本文中的研究样点为良渚古城遗址北墙TG2，即北墙中段保存较好的地段，有4m×30m的南北向考古发掘探沟1条，发掘面积120m2（图1-a）。探沟东壁的地层堆积可分为耕土层、近代层、灰褐色斑块土和黄褐色粉沙土等12层[16]。现场调查发现，遗址主要存在着水的侵蚀、裂隙、根部掏蚀、生物污损等病害，保存难度很大，目前已经采用搭建防雨棚等措施对土遗址进行了初步的保护。

2.2 样品采集

在“文物出土现场保护移动实验室”基础平台的支持下，项目组于2012年7月首先开展了研究样点的生物病害的现状调查，发现藻类、苔藓等光合生物已造成土遗址的大面积污染，考古文化层难以分辨。根据病害生物对考古土遗址造成污损颜色的差异选择3个采样位点（图1-b），其中L1位点大致位于探沟底部深褐色土层，病害生物呈深铜绿色的不规则圆形或斑块状分布；L2位点污染面积最大，呈浅黄绿色粉末状，覆盖了多个考古文化层；L3位点大致位于黄褐色土层，主要表现为绿色污染。在各位点随机选择了3个取样点，采用无菌解剖刀收集病害生物体，分别置于无菌Eppendorf管中，带回实验室后用于样品基因组总DNA的提取。

2.3 实验方法

2.3.1 基因组总DNA提取

使用PowerSoilTM（MOBIO Laboratories，Solanabeach，CA，USA）DNA提取试剂盒提取样品总DNA，分装后置于-70℃保存备用。

2.3.2 目标片段扩增

分别以样品总DNA为扩增模板，选择CYA106F和CYA781R引物，扩增蓝藻16SrDNA基因[17]；选择p23SrV_f1和p23SnewR引物，扩增藻类23SrDNA 质体序列[18]。反应体系（25μl）包括1U的Taq聚合酶，终浓度为0.2mM的dNTP，2.5μl10×反应缓冲液，单条引物浓度0.2mM，2.0μl模板（约含10ng DNA）。CYA106F和CYA781R引物对的扩增程序为：预变性94℃5min，然后在94℃变性45s，60℃退火45s，72℃延伸2min，完成35个扩增循环，终延伸72℃10min。p23SrV_f1和p23SnewR引物对的扩增程序为：预变性94℃2min，然后在94℃变性20s，55℃退火30s，72℃延伸30s，完成35个扩增循环，终延伸72℃10min。所有扩增产物用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段的大小与扩增特异性。

2.3.3 克隆文库构建与测序

扩增产物使用琼脂糖DNA纯化试剂盒进行纯化。取纯化后产物3μl，与pGEM-T载体（Promega）连接，并克隆至E.coli DH-5α受体菌制备的感受态细胞中。根据蓝白斑筛选固体培养平板（LB中AMP浓度为100μg/ml，X-Gal为60μg/ml，IPTG为20μg/ml），每一转化平板挑取约50—100个白斑，用T7/SP6引物对直接扩增验证插入片段大小。

2.3.4 序列比对及系统发生关系分析

将确定无误后的阳性克隆斑挑至液体LB试管中（含Amp 12μg/ml）37℃过夜培养，吸取1ml菌液送交测序公司完成序列测定（Shanghai Majorbio Bio-technology Co.， Ltd.）。所获序列使用MEGA5.2软件进行编辑[19]，并在NCBI基因数据库中利用BLAST程序GenBank完成比对和相似序列的筛选，使用邻接法（Neibor-Joining， NJ）构建系统发生树，靴值分析重复1000次。

三 实验结果

3.1 克隆文库序列

克隆文库测序后，CYA106F和CYA781R引物对共得到序列115条（序列号：KF358576-

KF358690），利用BLAST程序比对后发现，克隆文库中包含蓝藻序列20条，其他藻类序列12条，非藻类序列83条，其中细菌序列4条，苔藓植物叶

3.2 系统发生关系分析

在NCBI中利用BLAST程序比对所得序列与GenBank数据库中的相似序列，选择覆盖度及相似度最高的1—2条作为参考序列，构建CYA106F和CYA781R引物对的扩增产物16SrDNA及其相似序列系统发生树（图2）与引物p23SrV_f1和p23SnewR扩增产物23SrDNA及其相似序列系统发生树（图3）。

3.3 病害生物群落组成

通过序列比对，确定L1位点样品经CYA106F和CYA781R引物对扩增所得藻类序列主要隶属于念珠藻属（Nostoc），并占绝对优势；经p23SrV_f1和p23SnewR引物对扩增藻类序列主要隶属于蓝藻门（Cyanophyta）念珠藻属，为优势类群。L2位点样品经CYA106F和CYA781R引物扩增所得序列全部为非藻类序列，序列比对后发现其主要与苔藓植物门（Bryophyta）藓纲（Hepatopsida）薄囊藓属（Leptobryum）类群相近；p23SrV_f1和p23SnewR引物对未得到L2位点样品扩增产物。L3位点样品经CYA106F和CYA781R引物扩增所得序列所属门类较多，其中苔藓植物门薄囊藓属为优势类群，硅藻门（Bacillariophyta）菱形藻属（Nitzschia）与褐指藻属（Phaeodactylum）次之，蓝藻门壳藻属（Microcoleus）及未鉴定细菌类群最少；p23SrV_f1和p23SnewR引物扩增产物序列主要为藓纲薄囊藓属，其次为硅藻门菱形藻属，蓝藻门壳藻属、念珠藻属及绿藻门（Chlorophyta）未鉴定属所占比例最少。

四 讨 论

4.1 引物的特异性

本研究以良渚北城墙考古土遗址表面造成考古文化层覆盖严重的绿色病害生物体为检测对象，通过蓝藻特异性引物和藻类通用引物[17， 18]，重点研究造成土遗址病害的藻类组成。本研究所选的两个引物对在一定程度上均能实现潮湿环境中藻类病害的快速检测和初步的种属鉴定。但是，这两对引物的扩增产物中包含大量的非藻类序列，如L2及L3位点样品中的苔藓序列，这种非特异性扩增不利于对样品中藻类群落结构的整体水平的研究，但并不影响对遗产地病害藻类的初步鉴定。苔藓植物门叶绿体中16SrRNA也具有CYA106F和CYA781R的靶向扩增位点，主要可能是因为藻类与陆生植物叶绿体的16SrRNA序列具有较高的同源性[20]。然而该引物还无法解决苔藓植物科、属、种之间进化的问题，在今后的研究中有必要引入叶绿体基因23SrRNA、rbcL、trnL、trnF以及细胞核基因ITS、18S和26SrRNA等，开展各种苔藓植物间及内部系统发育关系的研究[21]。

4.2 主要病害类群

比对克隆文库所获序列后发现：L1位点主要受到了蓝藻门念珠藻属的污损；L2位点主要为苔藓植物门藓纲植物覆盖；L3位点的生物呈现出多样性，蓝藻、其他藻类、苔藓等均有出现。念珠藻为原核生物，没有以核膜为界限的细胞核，藻体为多细胞的丝状体，单一或多数藻丝在公共的胶质被中。多数念珠藻可作食用，如发菜、葛仙米、螺旋藻等，有一些种类是引起水体水华的主要种类，具有重要的生态意义。念珠藻陆生种主要生长在潮湿土表、岩山上，或混杂于藓类植物的茎叶间，有的可在表土下生活，它们也是造成考古遗址污损的主要类群。在印度阿旃陀石窟的湿壁画上、Bishnupur寺庙的陶器上以及其他考古遗址的表面，研究者发现造成遗址结痂的藻类主要有16种，分属于黏杆藻属（Gloeothece）、黏囊藻属（Myxosarcina）、念珠藻属（Nostoc）、眉藻属（Calothrix）等8个属[22]。本研究发现，在潮湿环境或潮湿状态下，良渚考古土遗址所处的自然环境条件与土体表面微生态环境都非常适宜念珠藻的生长，也很容易造成土遗址的生物污损。苔藓植物也多生长于阴湿的环境里，常见于石面、泥土表面、树干或枝条上。最新调查发现，位于印度锡布萨格尔市的阿洪王国考古遗址面临着严重的苔藓植物的入侵问题，7种主要苔藓对遗址的覆盖率达15%[23]。我国学者通过对潮湿环境下的土遗址病害的分类研究发现，杭州良渚遗址和南京大报恩寺遗址均存在苔藓病害，不仅影响土遗址的原貌，而且还形成结皮层，增大遗址土的渗透性和储水性，非常不利于土遗址的保存与保护[11]。本研究中各位点群落的组成差异主要是由其所处位置土体内的水分含量所决定的。L1位点位于考古发掘探沟底部，受渗水影响，土体含水量最高，接近饱和；L3位点位于底部和发掘剖面的交汇地带，土体潮湿；而L2位点在考古发掘的竖直剖面上，位置稍高，土体含水量最低。众所周知，在植物界的演化进程中，苔藓植物本身代表着从水生逐渐过渡到陆生的类型。本研究进一步确定了造成良渚土遗址中植物损害的主要苔藓类群，同时发现原核藻类蓝藻、小型真核藻类硅藻和绿藻均也是造成土遗址污损的重要因素。

4.3 防治措施

对于遗址地病害生物的防治措施是文物保护工作者最关心的问题。化学杀灭作为一种便捷的手段，一直被大量采用，但这种措施所具有的环境高毒性、失效快、易筛选产生抗性菌株等不足仍然无法克服。法国拉斯科洞穴的史前壁画曾因安装人工连续照明系统而导致大量绿藻的入侵，并被迫于1963年停止对公众开放。洞穴管理方先后采用链霉素、青霉素、甲醛、生石灰、苯扎氯铵等来应对不断变化的微生物病害问题，然而最新研究表明，被广泛使用的季铵盐类生物杀灭剂苯扎氯铵（Benzalkonium Chloride，BC，又称洁尔灭）不仅对青枯菌（Ralstonia spp.）和假单胞菌（Pseudomonas spp.）无效，反而可被黑酵母（Black yeast）作为碳源代谢利用，加剧壁画微生物病害的程度[24]。相比而言，一些新型的物理杀灭措施以其低成本、生态环境友好等优势而逐渐发展起来。如最近有研究称，使用60℃热休克处理法可杀灭所有的供试验苔藓植物，经热休克预处理后，便可用低于当前有效杀灭剂10倍浓度的化学杀灭剂完全杀灭[25]。针对潮湿环境下的土遗址，有研究指出，导致潮湿环境下土遗址破坏的主要诱因依次是大气降水冲刷、地下水位波动和空气湿度变化[12]，控制水环境的是解决潮湿环境土遗址保护的关键因素和先决条件[13]。另外，基于藻类与苔藓植物的光合自养特性，控制遗产地的光照也可以起到事半功倍的效果。潮湿环境土遗址表面的藻类、地衣、苔藓等病害生物的防治必须结合物理杀灭与清除、化学杀灭以及环境因子的控制等措施，以构建综合防治体系。

五 结 论

基于CYA106F/CYA781R和p23SrV_f1/p23

SnewR引物对的分子生物学技术可满足遗产地多数病害藻类的检测及优势类群的快速鉴定。

良渚北城墙考古遗址表面的病害生物主要为蓝藻门念珠藻属类群和苔藓植物门薄囊藓属类群，硅藻门菱形藻属与褐指藻属类群次之，蓝藻门壳藻属与绿藻门未鉴定属所占比例最低。

各采样位点的空间位置与土体含水量的差异成为光合藻类与苔藓类群组成的决定因素。

致谢：浙江省文物考古研究所和良渚管委会人员在采样过程给予了大力帮助，在此深表谢意！

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