农杆菌介导的黄瓜未受精子房培养遗传转化体系的建立

魏爱民 杜胜利 韩毅科 刘楠

摘 要： 为了建立一种直接获得转基因纯系的转化方法，首次开展了农杆菌介导的黄瓜未受精子房培养遗传转化体系研究。试验以除草剂草胺膦为选择标记，胚胎发生阶段，最适除草剂质量浓度为0.5～1.0 mg·L-1，幼苗生根阶段除草剂质量浓度为2.0 mg·L-1；以羧苄青霉素为抑菌剂，最适抑菌质量为450 mg·L-1；最佳浸染方法为OD600=0.3农杆菌工程菌，浸染10 min；共培养时间为3 d；在浸染菌液和共培养基中加入0.01% 的silwet-77，有利于获得较多抗性胚胎及抗性植株。该遗传转化体系的建立，为黄瓜转基因方法研究开辟了新途徑。

关键词： 黄瓜； 未受精子房； 农杆菌； 转化体系

黄瓜是我国人民喜食的蔬菜之一，消费量大，种植面积广。近年，随着人民生活水平的提高，对黄瓜新品种提出了更高要求。由于黄瓜遗传基础狭窄，依靠现有材料很难选育出商品性、抗病性、品质性状等方面均具有突破性的新品种。基因工程方法可以创造性地获得新材料，特别是通过常规育种方法不能获得的育种新材料。基因工程技术在水稻品种改良上得到了广泛的应用，我国已成功选育了抗虫、抗除草剂、抗病、养分高效、耐盐和高产等一系列转基因水稻品系/组合[1]。

黄瓜转基因研究开始于上世纪90年代，研究者对遗传转化体系进行了大量研究，应用较多的转化方法主要为：以体细胞再生体系为基础的农杆菌介导法[2-4]、花粉管通道法[5-6]，研究者已对黄瓜抗病[7]、抗虫[8]、抗逆[9]、品质[10]、产量[4]等相关性状基因进行目的基因转化研究。但上述转基因研究中存在转化率低、基因型差异明显、转化体多为嵌合体、多代筛选才能获得抗性纯合株系、重复性差等问题。目前，黄瓜的转基因研究尚未应用于育种实践。

黄瓜未受精子房培养技术已获得成功，并进行育种应用[11]。该方法通过离体培养未受精子房，诱导离体雌核发育，并自然加倍形成双单倍体植株，直接获得性状纯合的育种材料，育种效率大幅提高，最高离体雌核胚胎发生频率为85%，植株再生频率为25%。本研究拟应用黄瓜未受精子房培养技术体系，进行农杆菌介导的遗传转化方法研究，旨在建立一种直接获得转基因纯系的转化方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 黄瓜未受精子房培养高再生频率基因型材料W6。

1.1.2 载体及菌株 质粒载体：pCAMBIA3301，含有抗除草剂Bar基因。农杆菌工程菌株：含质粒载体的EHA105农杆菌工程菌。

1.2 方法

1.2.1 转化方法 采集开花前2～3 d的黄瓜未受精子房，用70%酒精表面灭菌后，再用10%次氯酸钠灭菌15～20 min，无菌水冲洗4次，无菌条件下，将幼嫩子房自顶部中心部位纵切或横切若干小块，备用。向OD值为0.2～0.5的稀释农杆菌工程菌液（经过2次摇菌后收集离心沉淀物重悬）中加入AS 50～100 [μ]mol·L-1、silwet-77等，浸染未受精子房5～20 min，期间不停摇动，使菌液与外植体充分接触。以无菌滤纸充分吸干外植体表面残存菌液，平放入诱导培养基，黑暗中共培养1～4 d，之后转接至含除草剂的选择培养基中，抗性芽高于1.5 cm时，转入生根培养基使其长成完整植株。

采用MS基本培养基，添加蔗糖30 g·L-1，琼脂6 g·L-1，pH 5.8；外植体置于组培室内培养，温度25～27 ℃，光/暗为16 h/8 h。外植体不同培养阶段使用的培养基为：（1）诱导培养基（共培养培养基）：MS+BA 0.5～1.0 mg·L-1；（2）抗性胚胎选择培养基：MS+ BA 0.5～2.0 mg·L-1+除草剂 0.5～1.0 mg·L-1+羧苄青霉素 450 mg·L-1；（3）生根培养基：1/2MS+除草剂 2.0 mg·L-1+羧苄青霉素 450 mg·L-1。

1.2.2 除草剂质量浓度的确定 胚胎诱导阶段除草剂筛选质量浓度的确定：在黄瓜未受精子房培养诱导培养基中添加0、0.05、0.1、0.5、1.0、2.0 mg·L-1的除草剂，比较其对未受精子房培养胚胎发生的影响，确定以除草剂进行转化体筛选的临界浓度。再生植株生根阶段除草剂筛选质量浓度的确定：将11 d苗龄的无菌苗，剪掉根系扦插于含有不同浓度除草剂的生根培养基中，研究除草剂浓度对幼苗生根的影响，确定以除草剂进行转基因再生小植株筛选的临界浓度。

1.2.3 不同质量浓度抗生素对黄瓜未受精子房胚胎发生的影响 在黄瓜未受精子房培养诱导培养基中添加0、150、300、450、600 mg·L-1的羧苄青霉素，比较其对未受精子房培养胚胎发生的影响，确定农杆菌浸染后适宜的抑菌浓度。

1.2.4 影响农杆菌介导的未受精子房遗传转化体系的因素研究 （1）农杆菌浸染方法研究：比较不同菌液浓度、浸泡时间等因素对未受精子房浸染后农杆菌抑菌效果的影响。（2）浸染菌液中添加不同浓度的silwet-77对转化体系胚胎及植株再生的影响：浸染菌液中添加浓度为0、0.01%、0.05% 的silwet-77，比较其对黄瓜未受精子房培养遗传转化体系胚胎及植株再生的影响。（3）共培养不同时间对转化体系胚胎及植株再生的影响：分别比较共培养2、3、4 d 对黄瓜未受精子房培养遗传转化体系胚胎及植株再生的影响。

1.2.5 数据统计 除草剂质量浓度、抗生素抑菌质量浓度的确定试验，每个处理浸染30个子房，3次重复；幼苗生根阶段除草剂质量浓度试验，每处理4株幼苗，3次重复；农杆菌浸染方法研究每处理3次重复，每处理共100个子房；共培养时间、silwet-77对转化体系的影响比较试验，每处理100个子房，未做重复。试验数据采用Duncan新复极差法进行差异显著性分析。数据计算公式：

胚胎发生率/%= 发生胚胎（抗性胚胎）数/接种子房数×100

植株再生率/%= 再生抗性植株数/接种子房数×100

生根率/%=生根植株数/幼苗数×100

萎蔫率/%=萎蔫株数/幼苗数×100

2 结果与分析

2.1 未受精子房培养遗传转化体系除草剂质量浓度的确定

2.1.1 胚胎诱导阶段除草剂质量浓度的确定 由表1可见：黄瓜未受精子房对除草剂比较敏感，较低浓度即可明显抑制未受精子房胚胎发生，随着除草剂质量浓度升高，胚胎发生频率呈明显下降趋

势。当除草剂质量浓度为0.50 mg·L-1时，胚胎发生率为18.9%，显著低于对照；当除草剂质量浓度高于1.00 mg·L-1即不能诱导胚胎发生。因此确定除草剂质量浓度0.50～1.00 mg·L-1之间，作为筛选除草剂抗性胚胎的临界浓度。

2.1.2 再生植株生根过程除草剂筛选质量浓度的确定 从表2可见：随着除草剂质量浓度的加大，植株生根及根生长受到明显抑制。当除草剂质量浓度为0.5 mg·L-1时，生根率较高，没有萎蔫植株；当除草剂质量浓度为2.0 mg·L-1时，生根率仅为33.3%，根长为0.3～1.0 cm，萎蔫死亡植株率为75.0%，此时，生根率低，萎蔫率高，明显低于或高于50%的临界标准。高于2.5 mg·L-1时，生根率下降明显，萎蔫率保持高值。因此确定幼苗期除草剂抗性植株筛选质量浓度为2.0 mg·L-1。

2.2 不同质量浓度抗生素对黄瓜未受精子房胚胎发生的影响

羧苄青霉素是黄瓜转基因研究中常用的脱菌剂，初期抑菌质量浓度常为200～300 mg·L-1。诱导培养基中加入羧苄青霉素，会对黄瓜未受精子房培养胚胎发生产生影响。当诱导培养基中加入抗生素质量浓度低于450 mg·L-1时，未受精子房胚胎发生率略低于对照，当高于600 mg·L-1时，胚胎发生率显著下降，与其他组分处理差异显著（表3）。为了能有效抑菌而又不影响胚胎发生，因此在农杆菌介导的黄瓜未受精子房培养遗传转化研究中适宜的抑菌质量浓度为450 mg·L-1。

2.3 农杆菌介导的黄瓜未受精子房培养遗传转化体系的初步建立

2.3.1 农杆菌浸染方法研究 以未受精子房为外植体进行农杆菌介导的遗传转化研究时，由于未受精子房壁体细胞组织在培养初期即发生体细胞凋亡，生命力衰退，易被农杆菌感染，导致抑菌困难。针对该技术难题，本实验比较了菌液浓度、浸染时间的不同组合对未受精子房浸染后，抑菌效果及胚胎发生的影响（表4）。

从表4可见，当浸染菌液浓度较低时（OD600=0.3），浸染的未受精子房接种后污染率明显低于高浓度浸染菌液（OD600=0.6）；其中，浸染液浓度为OD600=0.3，浸染10 min时，污染率明显低于同浓度菌液浸染外植体20 min，为22%。当浸染菌液浓度较低时（OD600=0.3），胚胎发生率高于高浓度浸染菌液（OD600=0.6）；其中，浸染液浓度为OD600=0.3，浸染10 min时，胚胎再生率明显高于高浓度浸染菌液（OD600=0.6），为39.7%。因此，确定以农杆菌工程菌OD600=0.3，浸染10 min作为转化的基本方法。

2.3.2 共培养时间对遗传转化的影响 农杆菌菌液浸染未受精子房后，共培养时间的长短，直接影响获得转化体数量的多少，以及抗生素抑菌效果。试验分别比较了共培养2、3、4 d对黄瓜未受精子房培养胚胎及植株再生的影响。

结果表明（表5）：随着共培养时间的延长，除草剂抗性筛选过程抑菌难度逐渐加大。共培养4 d时，外植体污染率为80%，明显高于共培养2、3 d时，且未获得再生胚胎。共培养2、3 d时，外植体污染率、胚胎发生率、植株再生率均无较大差异；其中，共培养3 d时，胚胎、植株再生率略高于共培养2 d时的结果。考虑到较长的共培养时间可能有利于外源基因转化，因此以共培养3 d为好。

2.3.3 菌液中加入表面活性剂silwet-77对黄瓜未受精子房培养遗传转化的影响 Silwet-77作为一种表面活性剂，常用于Floral dip 遗传转化中，以增强浸染菌液的渗透能力。黄瓜离体雌核发育为未受精子房胚囊内细胞发生分裂、形成胚胎。胚囊组织被多层子房壁、珠被等体细胞包裹，不利于农杆菌渗透入胚囊细胞，完成转化。因此，本研究比较了浸染菌液及共培养培养基中加入不同浓度的silwet-77对未受精子房培养遗传转化的影响。

由表6可见，菌液及共培养培养基中加入不同浓度的silwet-77后，随着silwet-77浓度的增加，除草剂抗性筛选过程，外植体污染率呈明显上升趋势。当silwet-77浓度为0.01%时，抗性胚胎发生率及植株再生率高于对照；当silwet-77浓度为0.05%时，胚胎发生率及植株再生率明显低于对照。可见，菌液及共培养基中加入低浓度silwet-77，抗性筛选时农杆菌较易被控制；适当浓度的silwet-77对胚胎发生及转化率的影响有待进一步研究。

3 讨 论

胚囊被认为是遗传工程的理想受体[12]，其原因主要为：胚囊内细胞具有天然原生质体的结构，有利于外源基因的引入；胚囊内的卵细胞正处于一个世代交替的转折阶段，是易受外来物质影响的敏感时期；卵器细胞再生力强，有利于转化细胞再生成植株；胚囊体积大、结构特殊，有利于进行微量注射引入外源DNA。因此，研究者以子房为转化受体，通过子房注射法、Floral dip等方法，已在棉花[13]、玉米[14]、拟南芥[15]、油菜[16]等作物获得转基因植株。黄瓜未受精子房培养技术，可直接获得育种应用的纯系，从而大幅提高育种效率，目前，国内外仅少数单位拥有该项技术并实现规模化应用。本研究应用已建立的高效黄瓜未受精子房培养技术，探索以胚囊内细胞为转化受体进行转基因研究，尚未见报道。

试验分別研究了黄瓜未受精子房胚胎发生及幼苗阶段除草剂质量浓度，发现黄瓜植株对除草剂表现敏感，极低浓度可产生药害。黄瓜未受精子房培养不同发育阶段，对除草剂质量浓度的耐受性不同，胚胎诱导阶段除草剂质量浓度为0.5～1.0 mg·L-1，幼苗生根阶段为2.0 mg·L-1。赖来等[17]以黄瓜子叶为外植体进行农杆菌介导的遗传转化研究，在抗性芽诱导阶段与幼苗生根阶段，分别采用不同质量浓度的除草剂进行筛选，其中幼苗生根阶段除草剂质量浓度为2.0 mg·L-1，与本研究结果一致。

抑菌困难，是研究建立黄瓜未受精子房遗传转化体系必须解决的关键问题之一，其污染原因主要为农杆菌不能有效抑制以及接种材料灭菌不彻底。本研究初步比较了不同菌液浓度、处理时间对选择培养抑菌程度的影响。确定OD600=0.3时，浸染10 min，作为农杆菌浸染未受精子房的最佳方法，该方法依然存在转化处理后胚胎再生率较低，存在一定污染等问题。针对该问题，可进一步开展菌液浓度、处理时间等转化方法对抑菌效果影响的比较试验；探索头孢霉素等其他抗生素对未受精子房培养胚胎发生及抑菌效果的影响。对于来源于材料本身的杂菌污染，后续试验可在材料盛花早期集中进行，此时材料新鲜，易于灭菌；也可适当延长材料灭菌时间，确保材料没有杂菌污染；或先采用短期预培养，再进行转化处理，对选择培养时农杆菌抑菌，可能会有好的作用。

Floral dip转化方法是一种以活体植株生殖细胞为转化体的转化方法，Silwet-77是Floral dip 遗传转化中有效的表面活性剂[18]。有试验表明将Silwet-77添加入农杆菌菌液，采用涂抹或浸泡黄瓜幼嫩子房进行转化处理，有利于提高转化效率[19]。本研究方法在离体条件下以未受精子房为转化体，与上述方法有相似之处。本研究中加入Silwet-77后，随Silwet-77浓度的增加，外植体污染率上升，说明浸染菌液对外植体内部组织的浸染能力增强。另外，当silwet-77 浓度较高时（0.05%），胚胎发生率及植株再生率降低，且明显低于对照；当silwet-77 浓度较低时（0.01%），胚胎发生率及植株再生率略高于对照。Silwet-77对胚囊内细胞生长发育的影响，有待通过细化试验设计进一步研究。找到适当浓度的Silwet-77，有可能提高农杆菌介导的未受精子房转化方法的转化率。

本研究初步建立了黄瓜未受精子房遗传转化体系，但该体系存在转化处理后胚胎再生率、植株再生率低等问题，直接影响转基因植株的获得。后续完善试验在转化体筛选过程中可进行延迟筛选，或采用初期低质量浓度、后期高质量浓度的方法，以获得更多转化植株。

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