响应面法优化琼胶酶发酵培养

修爽 祖国仁

摘要[目的]优化海洋细菌Vibrio agarivorans1产琼胶酶液体发酵培养基的最佳组分。[方法]首先通过单因素试验筛选出3个重要因子（琼脂、NaCl和酵母膏质量浓度），在单因素的基础上，通过BoxBehnken试验设计和响应面分析法确定了3个因子的最优发酵条件。[结果]最佳营养组分为：琼脂粉质量浓度为3.9 g/L，NaCl质量浓度为45.2 g/L，酵母膏质量浓度为12.9 g/L，此条件下酶活力达到7.589 U/g，比优化前提高了3.35倍。[结论]该研究对提高海洋细菌Vibrio agarivorans1产琼胶酶具有重要意义。

关键词海洋细菌Vibrio agarivorans1；琼胶酶；响应面

中图分类号S188；TS201.6文献标识码A文章编号0517-6611（2014）23-07729-03

作者简介修爽（1989- ），女，辽宁鞍山人，硕士研究生，研究方向：海洋微生物。

收稿日期20140710琼胶酶能将琼胶多糖降解为琼胶寡糖，目前琼胶寡糖已广泛应用于食品业、化妆业和医药工业，如作为抗氧化剂、功能性食品基料、天然防腐剂、淀粉老化抑制剂及高甜度甜味剂的填充剂和分散剂[1-3]等。同时琼胶酶也是分解海藻获得单细胞或原生质体及推测其多糖结构的一种重要工具酶[4]。利用琼胶酶降解琼胶是制备低聚糖的一个重要途径，由于其具有专一性，可选择性地酶切特定链的特定位置，且反应条件温和，降解流程易于控制，属于绿色环保的技术，这有利于寡糖的规模化制备，使酶解法在多糖降解中的应用日益增加。

ENOKI等[5]认为琼胶寡糖具有诱导细胞调亡、抑制NO等作用。另有研究发现琼胶寡糖具抗氧化[6-7] 、促进双歧杆菌生长、清除自由基等多种生理功能[8-9] 。

笔者通过单因素试验，确定对酶活影响较显著的因素并选出不同因素的最优条件，最后利用响应面法确定最优培养基组分和酶活最优值。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1菌种。海洋细菌Vibrio agarivorans1，大連工业大学生物学实验室保藏（大连黑石礁附近海域的江篱中分离得到）。

1.1.2培养基。试管斜面培养基（2216培养基）：琼脂粉20 g/L、蛋白胨 5 g/L、酵母膏1 g/L、磷酸铁0.1 g/L、海水1 L，pH 7.2。

液体种子培养基：蛋白胨5 g/L、酵母膏10 g/L、CaCl2 0.5 g/L、NaCl 25 g/L、FePO4 1 g/L、K2HPO4 1 g/L、FeSO4 0.3 g/L，pH 7.2。

液体发酵培养基：琼脂粉2 g/L、蛋白胨5 g/L、酵母膏10 g/L、CaCl2 0.5 g/L、NaCl 25 g/L、FePO4 1g/L、K2HPO4 1 g/L、FeSO4 0.3 g/L，pH 7.2。

1.1.3仪器与试剂。仪器：ZPS250智能生化培养箱，黑龙江东拓仪器有限公司；HH恒温水浴锅，巩义市英峪生化仪器厂；TGL16G高速离心机，上海安亭科学仪器厂；ZHWY2120C恒温培养振荡器，上海智城分析仪器制造有限公司；722S可见分光光度计，上海分析仪器厂；琼脂粉，北京博奥星生物技术责任有限公司。

1.2方法

1.2.1DNS配制。甲液：将6.9 g结晶苯酚溶于15.2 ml 10%NaOH溶液，蒸馏水稀释至69 ml，在此溶液中加入6.9 g亚硫酸氢钠。

乙液：将255 g酒石酸钾钠溶于300 ml 10%NaOH溶液中，再加入880 ml 1%的3，5-二硝基水杨酸溶液。

将甲乙2溶液混合即得黄色试剂，储于棕色瓶中放置7～10 d后使用。在棕色瓶内保存1年有效[10]。

1.2.2 酶活力测定。分别取1 ml发酵液和1 ml含0.2%琼脂的磷酸缓冲溶剂于试管内，40 ℃恒温水浴锅加热30 min，再加入2 ml DNS试剂后沸水浴5～10 min，取出后定容至25 ml，以8 000 r/min离心10 min后取上清液用可见分光光度计在540 nm处测OD值[11-14]。

酶活力定义：以1 ml酶液1 min产1 U/g还原糖定义为一个活力单位。

酶活计算公式：1 000nΔA/kt，式中，ΔA为还原糖吸光值，n为发酵液稀释倍数，t为酶液的反应时间（min），k为标准曲线斜率。

1.2.3产酶方法。挑取1环菌苔至5 ml种子培养基中，28 ℃、150 r/min，培养24 h后将5 ml种子加入45 ml产酶培养基中（装于250 ml三角瓶中），28 ℃、150 r/min，培养一段时间后测定酶活。

1.2.4单因素试验。取一环菌株接入装有5 ml液体种子液培养基的试管中，28 ℃、150 r/min，培养24 h，再将5 ml种子加入45 ml的液体产酶培养基中（装于250 ml三角瓶中），28 ℃、150 r/min，培养一段时间后测定酶活性，研究琼脂粉质量浓度、酵母膏质量浓度、NaCl质量浓度对产酶的影响。

1.2.5响应面分析。以琼胶酶活性作为响应值，优化过程为：①在单因素试验的基础上筛选出对琼胶酶产量影响显著的因素进行因素水平设计。②利用响应面法Boxbehnken设计，最终确定最优发酵条件，并进行验证试验[15-16]。

2结果与分析

2.1单因素试验

2.1.1琼脂粉质量浓度对琼胶酶酶活力的影响。在发酵培养基中，去掉原有琼脂粉，分别加入1、2、3、4、5、6 g/L的琼脂粉，在28 ℃、150 r/min的条件下培养24 h。结果见。由可知，当琼脂粉质量浓度为3 g/L时，酶活达到最高值5.84 U/g，因此最佳琼脂粉质量浓度为3 g/L。琼脂是菌株产琼胶的诱导物，也是培养基中重要碳源，因此琼脂粉质量浓度对酶活性影响较大。

琼脂粉质量浓度对琼胶酶酶活力的影响2.1.2NaCl质量浓度对琼胶酶酶活力的影响。在琼脂粉质量浓度3 g/L的液体发酵培养基中，去掉原有NaCl，分别加入15、25、35、45、55、65 g/L的NaCl，在28 ℃、150 r/min的条件下培养24 h。结果见。由可知，在NaCl质量浓度为45 g/L时，琼胶酶酶活力达到最高为6.58 U/g。因为Vibrio agarivorans1为海洋细菌，因此NaCl的质量浓度对其影响较显著。当NaCl质量浓度过低时微生物所需的盐离子不足，不利于菌株产酶，质量浓度过高反而抑制微生物生长。

NaCl质量浓度对琼胶酶酶活力的影响2.1.3酵母膏质量浓度对琼胶酶酶活力的影响。在琼脂粉质量浓度3 g/L、NaCl质量浓度45 g/L的液体发酵培养基中，去掉原有酵母膏，分别加入6、8、10、12、14、16 g/L的酵母膏，在28 ℃、150 r/min的條件下培养24 h，结果见。由可知，当酵母膏质量浓度为12 g/L时酶活力达到最高值6.92 U/g。酵母膏为培养基中重要氮源，适量的氮源有利于微生物的生长，营养物质质量浓度太低不能满足微生物生长需要，过高也会抑制微生物生长。

酵母高质量浓度对琼胶酶酶活力的影响2.2响应面试验根据BoxBenhnken的中心组合试验设计原理[17]，综合单因素试验结果选取琼脂粉质量浓度、酵母膏质量浓度及NaCl质量浓度3个显著因素，响应值Y为琼胶酶酶活力，采用3因素3水平的响应面分析方法，因素和水平见。

以琼胶酶酶活力为响应值，菌株产琼胶酶酶活性影响因素响应面分析试验设计与结果见。

通过Design Expert7.0软件进行数据处理，结果见。从可以更直观地反映因素的交互作用对酶活的影响，NaCl质量浓度和酵母膏质量浓度曲线较陡，说明其对酶活影响较显著。

解得：X1=0.09 X2=0.02 X3=0.04，即菌株的最优培养基组分为：琼脂粉质量浓度为3.9 g/L，NaCl质量浓度为45.2 g/L，酵母膏质量浓度为12.9 g/L，最高酶活为7.602 U/g。为了检验模型预测结果的可靠性，依据响应面结果确定的最优培养基组分进行验证试验，得到的酶活为7.589 U/g，与模型预测值基本吻合。

3结论

利用响应面法确定海洋细菌Vibrio agarivorans1最佳产酶培养基组分为：琼脂粉质量浓度为3.9 g/L，NaCl质量浓度为45.2 g/L，酵母膏质量浓度为12.9 g/L，在此条件下进行了验证试验，得到的最高酶活为7.589 U/g，与响应面预测结果基本吻合。在响应面法确定的最佳培养基组分下，酶活力较优化前的2.261 U/g提高了3.35倍。

42卷23期修 爽等响应面法优化琼胶酶发酵培养基参考文献

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