针叶树诱导性防御反应研究进展

王颖等

摘要 在长期的进化过程中，针叶树逐步发展形成了由原生性防御和诱导性防御共同组成的防御体系，在抵抗机械损伤、病原菌侵染和植食性昆虫取食的过程中发挥了重要的作用。诱导性防御又分为结构防御和化学防御。文章分别从针叶树的周皮、韧皮部、木质部等组织结构的变化，萜烯类、酚类等化学防御物质的合成代谢等方面，描述了诱导性防御反应的特点和作用形式，总结了针叶树防御反应分子机制研究的最新进展。

关键词 针叶树；诱导防御；萜烯；萜烯合成酶

中图分类号 S763.7 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）03-00810-04

Abstract In the long term evolution， conifers have developed an advanced defense system consists of preformed defenses and induced defenses， which plays an important role in responses to mechanical damage， pathogen infection and insect herbivores. Induced defenses are of two basic types： constitutive defenses and chemical defenses. This review focus on the features and manifestations of induced defenses， described respectively anatomical changes in periderm， phloem and xylem， the biosynthesis of terpenoids and phenolics， and summarized latest progress of induced defenses molecular mechanism research.

Key words Conifers； Induced defenses； Terpenoids； Terpenoids synthase

针叶树是已知的在地球上存活最为久远的一类植物，它生长周期长，分布广泛，是生态系统的重要组成部分。在长期协同进化的过程中，针叶树发展形成了一套庞大而复杂的防御體系，用以抵抗生物入侵、杀菌和密封伤口。现代研究表明，针叶树的防御体系主要分为2种：即原生性防御（preformed defenses）和诱导性防御（induced defenses）。原生性防御是预先形成的基本防御系统，在树木受到侵染前就已经存在；诱导性防御是寄主树木的一个主动调节的行为，是原生性防御反应的继续和发展，指植物在受到外物入侵伤害之后，通过启动和激活某些基因，调控体内一系列的生理生化变化而产生的抗性反应。诱导性防御反应又分为结构防御（constitutive defenses）和化学防御（chemical defenses），诱导性结构防御指树木组织结构的改变、受伤部位的组织修复；诱导性化学防御主要是指次生代谢产物的重新合成以及群落间的化学通讯。这2种防御在发生时间上和防御机制上均不相同，但作为针叶树防御系统的重要组成部分，两者相互联系，相互协调，共同承担了寄主树木的防御任务。研究树木的防御反应，有利于在理论上进一步阐明寄主树木与昆虫、病原菌、环境之间的互作关系，对于抗性育种和病害虫的综合治理具有重要的指导意义，笔者将对针叶树的诱导性防御体系研究进行总结综述。

1 诱导性结构防御

1.1 创伤周皮 树体的周皮和皮层共同形成了一道通透性的屏障，同时也是阻挡一切生物和非生物伤害的第一道防线[1]。周皮由木栓形成层、木栓和栓内层构成。周皮部位的细胞大部分已经死亡，细胞壁变得木质化或栓化，这些特征使得周皮变得坚硬，但它并不是一个密闭的结构，周皮表面有许多的气孔，控制着茎干内外部的气体交换，因此，开放的气孔成了外来有害生物潜在的侵入位点。中穴星坑小蠹（Pityogenes chalcographus）和体型更大一点的六齿小蠹（Ips acuminatus）都可以由气孔进入到挪威云杉内部[2]。针叶树木在皮层受到创伤后能够引起受伤部位的组织坏死，与创伤位点相连的第一层细胞形成一个封闭层，在封闭层下方迅速形成新的次生保护组织——创伤周皮，直接影响了害虫的侵入行为及对侵入部位的选择。

1.2 次生韧皮部 针叶树的次生韧皮部是进行防御反应的主要部位，多酚薄壁细胞广泛存在于韧皮部组织中，它是分泌和储存酚类物质的场所，当多酚薄壁细胞被破坏时，细胞及时释放具有杀灭真菌和抑虫作用的酚类物质，是一种重要的初级防御策略[3-5]。多酚薄壁细胞的防御应答体现在细胞形态变化和细胞数量增加2个方面。挪威云杉在感染长喙壳属（Ceratocystis polonica）真菌后，多酚薄壁细胞液泡内的可溶性酚类物质明显增多，细胞体积膨胀[6-7]。当伤害严重或持久时，多酚薄壁细胞层内侧可分化出新的多酚薄壁细胞[7-8]。

1.3 木质部 树脂道系统是针叶树的基本特征，横向树脂道和纵向树脂道交错排列，形成一个立体的树脂管道系统。创伤树脂道（TRD）的形成发生在木质部，是由形成层细胞分化而成的轴向树脂道，截面呈环状排列[9]。创伤树脂道的形成属于一种滞后防御机制，发生时间较晚，通常需要2～8周。如挪威云杉在创伤后的第8天便开始分化创伤性树脂道的上皮细胞，直到创伤后第36天才形成成熟的创伤树脂道[10]。创伤树脂道和原有的树脂道一样，都具有分泌和储存树脂的功能，是树木获得系统抗性的标志[3]。

1.4 细胞程序化死亡 细胞程序化死亡（PCD），又称过敏反应，是多细胞有机体生命周期中正常的组成部分，是一种受基因调控的生理性细胞死亡。植物可以对特定的病原物进行识别，体内健康细胞在胞外信号的诱导下，激活死亡途径，导致局部组织坏死，从而限制病原物在侵染点的扩散。当外物停止入侵以后，坏死的组织会自动与健康树体组织分离脱落。细胞程序化死亡是高等生物长期进化的结果，是一种短期防御策略。

针叶树木的细胞程序化死亡现象可以发生在所有的受伤位点，包括皮层、韧皮部和木质部。组织病理学和细胞学等综合研究表明，树木的细胞程序化死亡主要是由害虫取食或机械损伤所引起的，受真菌本身的诱导非常有限[11-12]，但昆虫的伴生菌能刺激并放大这一过程[13]。如山松大小蠹伴生真菌加剧了美国黑松受伤部位细胞的程序化死亡[14]。

2 诱导性化学防御

植物与动物不同，不能主动躲避危害，因此，合成和释放化学物质成为植物的主要防御手段。针叶树的化学防御物质包括萜烯类化合物和酚类化合物，分别由类异戊二烯途径和苯丙烷类代谢途径产生。

2.1 萜烯类化合物 松脂是针叶树重要的防御物质，由树脂道的泌脂细胞分泌而成，是多种萜烯类物质的混合物。目前自然界已分离鉴定出3万多种不同结构的萜烯和萜烯类衍生物，它们都是以异戊烯基焦磷酸（IPP）为前体，在异戊烯基转移酶的催化下，形成多种多样的萜烯类物质[15]。根据所含异戊二烯数量的不同，分为单萜、倍半萜、双萜、三萜、四萜、多萜等。大量研究表明，生物和非生物胁迫都能诱导针叶树体内萜烯类物质含量的增加[16-18]。

双萜、三萜等分子量相对较大的萜烯类化合物为粘性油状物，当针叶树被昆虫啃食或机械损伤后，伤口处立刻流出粘性树脂，将暴露的伤口封闭，为昆虫和病原微生物的入侵设置了一道物理屏障。同时，具有高度挥发性的单萜和倍半萜类物质也对昆虫起到了趋避和致死的作用[19]。

针叶树通过调节挥发性物质的成分和含量比例，形成了各种各样的化学指纹图谱，起到了不同的间接防御效应。挪威云杉挥发物可以干扰小蠹虫对寄主的定位、影响其产卵[20]；南方松挥发物可以干扰小蠹虫信息素的释放，从而防止小蠹虫聚集攻击[21]；云杉树受小蠹虫为害后，释放的芳樟醇可以吸引小蠹虫的天敌长痣罗葩金小蜂（Rhopalicus tutela Walker）过来捕食[22]。

植物在遭受生物或非生物胁迫下，其诱导防御的水平迅速提高，然而，有些树木在从未受到损伤的情况下也能够提高防御的水平。原因是种群树木之间存在一种特殊的化学通讯，其受伤信息能在植株间传递，种群中的每一个个体都有可能随时被诱导。例如针叶树受害后释放出的挥发性萜类物质能引起邻株树木的抗性增加[23]，体现了生态防御的意义。

2.2 酚类化合物 酚类化合物是针叶树另一类重要的防御物质，在韧皮部多酚薄壁細胞中合成并储存[17，24]。主要包括单元酚（木质素、肉桂酸、香草酸）、二元酚（绿原酸）、多元酚（单宁）等。针叶树的酚类化合物可以快速地响应外界伤害，如十二尺小蠹（Ips sexdentatus）伴生真菌可以诱导樟子松内不同酚类物质的含量变化[25]。通常认为，酚类化合物含量的增加是伤害诱导的氧化反应，产生醌类化合物或单元酚和双元酚，对昆虫和病原物产生毒害作用。因此，酚类化合物被广泛认为是树体内的拒食素和抗真菌剂。

3 诱导性防御的分子机制

随着科学研究的不断深入，人们已开始从研究传统的防御物质的合成代谢转向分子生物学领域研究，通过鉴定相关的信号分子、关键酶基因的克隆以及表达规律分析，进一步揭示植物诱导性防御反应的分子机制。

3.1 防御应答的信号分子

3.1.1 茉莉酸类化合物。该类化合物广泛存在于植物体中，是一种重要的生物激素，在植物生长发育中具有多种生理功能，同时也是介导防御反应所必需的信号分子。茉莉酸类化合物包括茉莉酸（JA）、茉莉酸甲酯（MeJA）以及其他的衍生物等。针叶树受到机械损伤或昆虫取食后，茉莉酸含量迅速增加，且先于基因表达。用外源MeJA处理挪威云杉，在没有机械损伤的情况下模拟昆虫取食，结果发现MeJA诱导树木产生了与机械损伤和昆虫取食相似的防御效果，萜烯含量显著增加，在后期也可以形成新的创伤树脂道[26-27]。但是研究表明，MeJA并不是直接诱导这些变化的单一信号分子，而是处于信号通路的上游。

3.1.2 乙烯。乙烯在生理上属于一种气态的植物激素，被认为是茉莉酸下游的信号分子[28]。茉莉酸甲酯处理花旗松，可以诱导乙烯含量的升高[29]。用乙烯处理针叶树也可以诱导萜烯含量的增加和创伤树脂道的形成[26]。利用乙烯抑制剂1-甲基环丙烯（1-MCP）能够抑制针叶树创伤后的防御应答反应[29]，说明乙烯是针叶树启动防御反应的重要的信号分子。

3.2 防御基因表达

3.2.1 萜烯合成酶基因。萜烯合成酶（Terpene synthase，TPS）是萜烯类物质合成过程中的关键酶，按形成产物的不同，可分为单萜烯合成酶、倍半萜烯合成酶和二萜烯合成酶等[30-31]。目前，在针叶树中已报道了70多种TPS基因，主要集中在松科（Pinaceae），其中以大冷杉（Abies grandis）居多，挪威云杉（Picea abies）次之，而松属（Pinus）较少。已报道的这些TPS基因中，又以单萜烯合成酶基因居多，如蒎烯合成酶基因、柠檬烯合成酶基因、水芹烯合成酶基因等。

萜烯合成酶基因对伤害的响应是极为迅速的，mRNA积累最早可发生在创伤后2 h内，是针叶树重要的防御基因。已有大量研究证实，外界伤害可以诱导TPS基因上调表达，最终调控了下游萜烯类化合物的生成。北美云杉在受到象鼻虫取食后，α-蒎烯合成酶基因的转录水平在第1天便升到了2倍，第2～4天差异更加显著[9]。用钻孔的方式模拟象鼻虫取食，发现单萜烯合成酶基因（PsTPS-Lim）在创伤后6 h转录水平就开始增加，并在创伤后的第4～7天达到最高[32]。

3.2.2 细胞色素氧化酶P450基因。最新研究发现，除萜烯合成酶以外，针叶树中还存在一类酶，也参与调控了萜烯类化合物的合成，即细胞色素氧化酶P450（Cytochrome P450 monooxygenases，CYP450），它是一类血红蛋白超家族，是一种末端氧化酶。针叶树基因组中P450家族的总基因数量未知，目前在火炬松上已克隆出99种P450基因，但只有少数几种进行了功能鉴定，确认与萜烯合成过程相关。

通過对火炬松转录组数据分析，得到了P450家族成员CYP720B的基因信息，它也是一个庞大的基因家族，与TPS基因家族相似[33]。针叶树CYP720B基因能够被伤害诱导激活，在转录水平、蛋白丰度、酶活性水平上都得到提高，说明CYP720B基因是针叶树重要的防御响应基因。其中，CYP720B1基因以双萜烯、醇类、醛类为底物，至少连续催化了2次以上的氧化反应[33]。由于底物具有特异性和多样性的特点，少数几种P450基因即可调控合成多种双萜烯产物。白云杉CYP720B4基因最终催化了24种双萜烯的氧化反应[34]。

3.3 防御相关蛋白 针叶树防御蛋白主要指树体内的一些可溶性酶类，通常分子量小于100 kDa，包括结构相关防御蛋白和化学防御相关蛋白。树木受伤害诱导产生的酶类，如过氧化物酶、漆酶，可加速寄主细胞壁木质化，增加其硬度，在结构上阻挡有害生物的入侵行为。另一类化学防御相关蛋白，如几丁质酶、葡聚糖酶，它们可以破坏真菌细胞壁和细胞膜的完整性，抑制菌丝生长，具有直接的杀菌作用[35]。还有一些其他的蛋白，属于蛋白酶和淀粉酶抑制剂，能够降解有害生物分泌释放的消化酶的活性（如孔蛋白、凝集素），干预了有害生物对罹病组织的进一步伤害[36]。诱导防御蛋白具有很高的特异性，在挪威云杉中，几丁质酶是一个大的蛋白家族，但是真菌侵染只能诱导极少数的家族成员含量的升高[6]。

4 诱导性防御反应的代价

植物从感知外界胁迫到获得系统抗性，存在一定的时间间隔。通常在起初的几天内对胁迫伤害都很敏感，防御反应相对活跃，然而随着胁迫天数的增加，植物系统抗性得到了提高，自身的适应度却开始降低，这时因为植物的能量资源是有限的，植物为防御反应付出了代价[37]。在健康状态时，能量主要用于快速生长和繁殖；当受到伤害后，植物选择将有限的资源分配给次生代谢产物的合成，增加防御能力来维持生存，这种能量的消耗明显高于初生代谢。植物诱导性防御反应会消耗大量的氮元素，争夺合成蛋白质的前体，从而使植物的生长受到抑制。针叶树萜烯产物的合成步骤更为复杂，过程中需要大量的化学消耗和许多的酶解转化，其防御成本也更为昂贵。诱导性防御的代价是不可避免的，植物会设计出一套最佳的防御策略，只有在需要的时候，需要的部位，以必要的数量来消耗防御的能量，实现有限资源的最优化配置。

5 总结与展望

迄今为止，大量的有关植物防御反应的研究都集中在了草本植物，针叶树由于生长周期较长，并且可能会连续多年或同时受到多种病虫的危害，因此更需要加强自身的防御能力来进行保护，其防御机制也更为复杂。大冷杉和挪威云杉已成为研究针叶树防御反应的模式生物。茉莉酸类化合物也常被用来模拟机械损伤和昆虫取食危害的激发子。越来越多的研究开始着重于防御相关基因的克隆以及表达规律分析，旨在从分子水平上深度揭示针叶树的防御机制。在植食性昆虫、病原物与针叶树互作过程中，面对树木强大而复杂的防御反应，昆虫和病原物有着怎样的应对策略，它们是如何躲避、利用或降解针叶树木释放的“有毒”物质，这些都是值得关注的领域，对于树木的病虫害防治具有重要的意义。

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