植物过氧化物酶同工酶的研究进展

顾雯雯 胡亚婷 韩英 卞涵佳 罗兵 孙海燕 万能 杨志刚 沈宗根

摘要 过氧化物酶（Peroxidase，POD）是植物体内广泛存在的氧化还原酶，在植物体内具有多种同工酶。POD同工酶具有种属、器官以及发育階段特异性。它作为遗传标记广泛应用于植物的品种鉴定、遗传多样性分析、植物抗病性分析等方面。该研究综述了植物POD同工酶检测技术的研究进展以及POD同工酶的应用，提出进一步研究植物POD同工酶的建议。

关键词 植物;过氧化物酶同工酶;研究进展

中图分类号 S188  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2014）34-12011-03

Research Progress of Peroxidase Isozymes in Plants

GU Wenwen1， HU Yating2， HAN Ying3， LUO Bing1* et al

（1. College of Biology and Food Engineering， Changshu Institute of Technology， Changshu， Jiangsu 215500; 2. Suzhou Wuyuetian Organic Agriculture Science and Technology Co. Ltd.， Wujiang， Jiangsu 215216; 3. Wujiang Pingwang Battle Companion Grape Professional Cooperatives， Wujiang， Jiangsu 215221）

Abstract The peroxidase （POD）， existed widely in plants， was an oxidoreductase and had various isozymes. The peroxidase isozymes had specificity in species， organs and developmental stage. As a genetic mark， the peroxidase isozymes were widely used in varieties identification， genetic diversity analysis， disease resistance. This paper reviewed the advances of detecting method for analysis of peroxidase isoenzymes in plants and the application of peroxidase isozymes. Suggestions were put forward for the further research of peroxidase isozymes in plants.

Key words Plants; Peroxidase isozymes; Research progress

基金项目 江苏省青年基金项目（BK20140417）;苏州市科技计划项目（SZS201102，SYN201110，SNG201323和SNG201242）;江苏省大学生实践创新训练计划项目（201310333032Y）;苏州市吴江区科技计划项目（WN201311，WN201317）;常熟市科技计划项目（CS201205）。

作者简介 顾雯雯（1992- ），女，江苏苏州人，本科生，专业：植物生物化学。*通讯作者，副教授，博士，从事植物生物化学与分子生物学方面的研究。

收稿日期 20141024

过氧化物酶（Peroxidase，POD）是植物体内广泛而大量存在的、活性较高的一种氧化还原酶。它能催化植物体内多种反应，参与光合作用、呼吸作用、抗病作用、植物生长等众多生理活动。POD在植物体内具有多种同工酶。在植物不同的组织器官、不同的生长发育时期、不同的生理状态（如病虫害、逆境胁迫等）和不同品种中，POD同工酶的活性和数目变化都很大。POD同工酶能够在很大程度上反映植物生长发育的特点、生物代谢状况、适应外界环境能力以及品种之间的遗传差异[1]。POD同工酶的电泳图谱在一定条件下比较稳定，并且与形态学性状指标一样具有种属专一性。它作为遗传标记已被广泛应用于植物的品种鉴定、遗传多样性分析、植物抗病性分析、植物生长发育分析等方面[2-3]。笔者对植物体内POD同工酶检测技术的研究进展以及POD同工酶应用进行了总结，以期为开展该领域的进一步研究有一定的指导作用。

1 过氧化物酶同工酶检测技术研究进展

1.1 非变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳

非变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native PAGE）不易使蛋白质变性，也称生物大分子天然状态聚丙烯酰胺凝胶电泳。它基本不破坏蛋白质的天然构象以及亚基间的相互作用，因此它可以保持蛋白质生物活性。该方法由于没有使蛋白质变性，在植物POD同工酶的检测中应用最广泛。谢莉等[4]利用Native PAGE技术分析了3份高粱品种及其F1代的过氧化物酶同工酶，结果显示甜高粱和栽培高粱POD同工酶的酶谱类型相近，而二者的酶谱比拟高粱的酶谱少1条带;杂交F1 代POD同工酶的酶谱既有互补双亲酶带的“互补带”POD1，又有新的“杂合带”POD4，但未表达出双亲共有的酶带POD6。刘鹏等[5]也采用该方法对10份蓖麻的POD同工酶进行了分析，确定矮化蓖麻的特征谱带为相对迁移率最小的谱带，POD同工酶酶带的多少能够鉴别蓖麻的高矮类型。该方法在苦豆子和狼牙刺等植物材料中也被用于POD同工酶的检测[6]。但，该方法分辨率较低，酶带模糊且较宽，对同源性较高同工酶的分离能力很差。

1.2 复性电泳

复性电泳（Sodium dodecylsulfategelatinpolyacrylamide gel electrophoresis，GPAGE）是在20世纪80年代初建立起来的一种电泳技术，是一种电泳后仍然保持酶生物活性的电泳。它与非变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳的区别，主要是先用十二烷基磺酸钠（SDS）将蛋白质变性，电泳结束后利用非离子去垢剂（如tritonX100）洗去蛋白质结合的SDS，使酶恢复生物活性[7]。姬生栋等[8]利用复性电泳技术（GPAGE）对小麦POD同工酶进行了研究，结果表明该技术能检测小麦植物中POD同工酶，并且不同生育期小麦叶片中POD同工酶的种类和活性都不同。廖海等[9]利用复性电泳技术在5份菖蒲材料上成功检测了POD同工酶，结果表明该方法比PAGE同工酶电泳分析方法具有酶带边界清晰、分离效果更好、试验条件容易掌握等优点。

1.3 十二烷基磺酸锂不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳

十二烷基磺酸锂不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳（LDSPAGE）中十二烷基磺酸锂（LDS）对蛋白质的变性作用比SDS低。该电泳技术與GPAGE的主要区别就是电泳后不需要酶复性步骤。该技术在分离动物和细菌的血红素蛋白中效果都较好[10-11]。王爽等[12]利用LDSPAGE技术对高粱和甘蓝型油菜的POD同工酶进行了研究，在高粱和油菜中分别检测到8、7条POD同工酶条带，并且发现LDSPAGE技术比GPAGE技术灵敏。尽管如此，还有待于进一步研究该方法的具体操作步骤。

1.4 等电聚焦电泳

等电聚焦电泳（Isoelectric focusing electrophoresis，IFE）与以上电泳最主要的区别是要利用两性电解质在凝胶内制造一个pH梯度。电泳时，每种蛋白质将迁移到的位置是与其等电点（pI）相等的pH处。邱竟等[13]利用等电聚焦电泳对棉花不育系进行研究时，棉花质核雄性不育系、保持系、恢复系的子叶、真叶、茎、花药等组织在pH 4～6成功检测到20种不同的过氧化物酶同工酶带。周楠等[14]利用等电聚焦电泳技术分别在四倍体和二倍体棉属植物中检测到POD同工酶，并且棉属种间的酶谱关系与形态学、细胞学和遗传学的研究结果基本一致。徐建龙[15]利用等电聚焦电泳技术也成功地对水稻细菌性条斑病抗性中的POD同工酶进行了测定，结果显示抗病亲本和杂交后代的POD同工酶谱带尽管有差异，在等电点pI 4.2～6.2之间都能检测到POD同工酶。

1.5 过氧化物酶的染色方法

POD的染色方法有很多，但染色基本原理都一样。 POD主要是利用H2O2氧化供氢物质，如果供氢体被氧化后生成有色沉淀，酶活性区就会发生呈色反应。POD对H2O2的专一性非常高，但对供氢体没有严格要求。因此，供氢体不同，其染色配方就不同，并且供氢体相同时，染色液的配方比例和辅助添加试剂也可以不同，从而形成不同的染色方法。已有很多研究将联苯胺、邻联太茴香胺、愈创术酚、香酚、3氨基9乙基咪唑等试剂作为供氢体，其中联苯胺应用最广泛[1-2，5，12-14]。在以联苯胺为供氢体时，辅助添加物还可加不同的试剂如抗坏血酸（Vc）、NH3Cl和醋酸等。程东升等[16]研究显示，酶带检测的灵敏性顺序为NH3Cl-联苯胺法> 联苯胺法>愈创术酚法和Vc联苯胺法>饱和联苯胺法。王秀芬[17]却认为，染色效果最好的是醋酸-联苯胺染色液，抗坏血酸-联苯胺染色液次之，染色效果最差的是联大茴香胺染色法。

2 过氧化物酶同工酶应用的研究进展

2.1 POD同工酶在鉴别品种上的应用

POD同工酶酶谱具有种属特异性。POD同工酶酶谱的差异能客观地反映物种间的遗传。利用POD同工酶对物种进行辅助鉴定，是一种比较简单、有效的手段。刘红燕[18]构建了鬼针草属6种植物的POD同工酶PAGE指纹图谱，结果显示构建的POD同工酶PAGE指纹图谱能把金盏银盘（Bidens biternata Merr.et Scherff）、矮狼杷草（Bidens tripartita L.var.repens（D.Don.）Sherff）、鬼针草属大狼杷草（Bidens frondosa L.）、小花鬼针草（Bidens parviflora Willd.）、狼杷草（Bidens tripartita L.）、婆婆针（Bidens bipinnata L.）等6种鬼针草属植物一一区别开。赵晓平等[19]研究表明，利用POD同工酶能够区分、鉴别加拿大杨、天杨、新疆杨、河北杨、小叶杨等5种杨树。张春等[20]在分析泥炭藓属植物的POD同工酶时，发现POD同工酶能将加萨泥炭藓和尖叶泥炭藓区分、鉴别出来，但不能将泥炭藓、多纹泥炭藓和卵叶泥炭藓区分开。马玉花等[21]研究表明，POD同工酶的POD2谱带仅出现在兰果忍冬中，POD3谱带仅出现在红脉忍冬中，POD2和POD3可以用作鉴定上述2种植物的依据。

2.2 POD同工酶在不同组织之间的比较应用

研究表明，植株不同部位POD同工酶的谱带有很大差异。由此可见，过氧化物酶存在着明显的组织器官特异性。高勇等[22]对苹果不同组织器官的POD同工酶进行了研究，发现花药的酶谱比较稳定，而随着果实的发育，果肉中POD同工酶谱带逐渐减少，酶活性逐渐降低，胚珠的酶带却逐渐增多，酶活性增强。全妙华等[23]也分析了四棱豆不同节位叶片、各器官的POD同工酶，结果显示POD同工酶谱带在各组织器官中的分布具有明显的器官特异性，而成熟叶片中的分布在不同节位都很稳定。孙丹等[24]研究发现，平贝母在组织培养过程中，各培养体不同发育时期的POD同工酶谱带在形成小鳞茎后比较稳定，而且酶谱带数最多，为8条;在Rf为0.275处，愈伤组织出现了特异性谱带，而培养体在其他时期没有出现此带，并且在刚形成小鳞茎时其活性也达最高，说明平贝母的过氧化物酶参与鳞茎的形成与发育。

2.3 POD同工酶在分析植物间亲缘关系的应用

POD同工酶是单基因控制。POD同工酶酶谱的差异能够反映基因所处的遗传背景差异。赵沙沙等[25]利用POD同工酶分析了黄金冠、锦绣、锦黄2号、黄桃l9、锦黄4号和锦黄3号6个黄桃品种（品系）之间的遗传亲缘关系，结果表明锦绣与黄金冠之间的POD同工酶酶谱最相似，遗传亲缘关系最近，它们与其他4个品系间的遗传亲缘关系则较远。区炳庆等[26]利用POD同工酶对南瓜属6个不同品种进行了亲缘关系分析，结果表明龙凤瓜和珠瓜遗传亲缘关系最近;观南l 7和早自矮遗传亲缘关系最近;鱼翅瓜与观南l 7、早自矮遗传亲缘关系较近，与龙凤瓜、珠瓜的遗传亲缘关系则较远;大南瓜与观南l 7、早自矮遗传亲缘关系较近。张光花等[27]利用POD同工酶分析了胡葱、洋葱和葱的亲缘关系，发现胡葱与洋葱的遗传亲缘关系比较近，而胡葱与大葱的亲缘关系相对较远。夏齐平等[28]利用POD同工酶对石蒜属种间和石蒜居群间进化关系进行了研究，结果显示忽地笑与中国石蒜之间的遗传亲缘关系最近。这与细胞学和形态学的研究结果都很接近。另外，POD 同工酶的研究結果还表明，石蒜居群间遗传距离与地理距离没有相关性存在。

2.4 POD同工酶在分析植物抗性的应用

众多的研究表明，过氧化物酶参与植物的抗病、抗虫、抗盐、抗旱以及抗生物胁迫等生理反应。朱友林等[29]研究了玉米抗大斑病菌基因与过氧化物酶同工酶的关系，发现POD活性及其同工酶电泳图谱，在同一遗传背景中不同抗病和感病品系间差异小，而在不同遗传背景间差异大，说明POD活性和POD同工酶酶谱在抗病过程中的变化与抗病基因所处的遗传背景关系十分密切。 徐建龙[15]研究了水稻细菌性条斑病抗性与POD同工酶的关系，结果表明细菌性条斑病对感病和抗病水稻叶片POD同工酶谱带的影响不同，二者在等电点为4.2～5.3之间的酶带差异最大，说明细菌性条斑菌能诱导POD等位基因的表达，最终呈现为POD同工酶谱带的变化。马峙英等[30]对POD同工酶与棉花黄萎病抗性的关系也进行了研究，显示海岛棉的PODPC1酶带基因和海岛棉对黄萎病的抗性都是显性单基因遗传，并且PC1酶带的表现与棉株对黄萎病抗性能力呈显著相关，PC1条带如果弱，则棉株具有抗病性，反之PC1酶带若强，则棉株易感病，从而证明POXPC1同工酶可能与棉花品种抗黄萎病有关。史学群等[31]在研究橡胶树抗炭疽病的试验结果与马峙英等[30]研究结果有一些差异。在接种炭疽病后，抗性品系橡胶树POD同工酶有新的酶带产生，条带显色也较快，高感品系橡胶树没有产生新的酶带。大麦、油菜上的研究也表明，POD同工酶与抗黄花叶病有密切关系[32]。

2.5 POD同工酶在分析种子纯度的应用

POD同工酶用于种子纯度的研究已有很多报道，但其分析结果不稳定。周敏等[33]利用POD同工酶检测花生“汕油523”的种子纯度，并且发现与大田检测结果基本一致。梅德圣等[34]利用POD同工酶对油菜种子纯度进行了鉴定，结果显示母本6098A比父本R5和杂种F1 少一条迁移率（Rf）为0.41的条带。该特征条带用来鉴定杂种纯度时比较粗放，不能鉴定出父本杂株。马国斌[35] 利用淀粉凝胶电泳技术对西瓜杂交种无籽西瓜“黑蜜二号”、“西农八号”及其父母本苗期子叶的POD同工酶进行了分析，结果显示杂交种及其父母本间的POD同工酶酶谱均有差异，在“西农八号” 12 d苗龄的子叶和“黑蜜二号” 5 d苗龄的子叶中其POD同工酶酶谱的差异最明显，鉴定种子纯度的结果与田间鉴定的结果吻合。而黄永红等[36-37]都不能利用POD同工酶对杂交西瓜的种子纯度进行检测。

3 展望

来源相同、催化性质相同而分子结构有差异的一类酶蛋白分子称为同工酶。同工酶在生物界中广泛存在，具有明显的种属、发育阶段和组织器官的特异性，是生物体一种重要的生理指标，也是生物体可靠的遗传标记。高等植物中过氧化物酶同工酶广泛而大量地存在。它参与植物的光合作用、呼吸作用、生长发育、抗病虫害、抗逆境胁迫等。POD同工酶的差异在一定程度上反映植物个体之间基因的差异。分析POD同工酶，可将表观的遗传特性与微观的分子基础紧密地联系起来。由于POD是单基因控制，POD同工酶在很大程度上反映种、品种间的遗传物质差异[1]，因此把它用作鉴定种、品种的一种指标，具有很好的参考价值;另外，在种质资源遗传亲缘关系的研究方面，它比形态学指标更能准确地反映其遗传背景的差异。

为深入了解植物过氧化物酶同工酶，今后要进一步加强植物过氧化物酶同工酶检测技术的研究，同时要更广泛地扩展过氧化物酶同工酶的应用领域，为各种研究和生产服务。

42卷34期

顾雯雯等 植物过氧化物酶同工酶的研究进展

参考文献

[1] 周卫生.早熟·晚熟猫尾草过氧化物酶同工酶及抗寒性分析[J].安徽农业科学，2010，38（32）：18011-18013.

[2] 孙睿，邵红，刘娟，等.北马兜铃不同器官花期过氧化物酶同工酶研究[J].特产研究，2012（2）：34-35.

[3] 沈光华，许燕，庄薇薇.大麦、油菜的抗耐病性与过氧化物酶同工酶的关系[J].上海师范大学学报：自然科学版，2001，30（3）：52-55.

[4] 谢莉，曾艳华，李冬郁，等.3个高梁品种及其F 的过氧化物酶同工酶分析[J].广西农业科学，2007，38（6）：618-620.

[5] 刘鹏，张春兰，栾世惠，等.10种蓖麻过氧化物酶同工酶分析[J].内蒙古民族大学学报：自然科学版，2011，26（3）：313-315.

[6]丁锐，吴三桥.苦豆子和狼牙刺过氧化物酶同工酶的研究[J].西部林业科学，2005，34（3）：67-68.

[7] NEUHAUSSTEINMETZ U，XU C，FRACELLA F C，et al.Heat shock response and cytotoxicity in C6 rat glioma cell：structureactivity relationship of different alcohols[J].Mol Pharmacol，1994，45：36-41.

[8] 姬生栋，李金亭，吉爱玲，等.小麦生育前期POD同工酶的动态变化[J].广西植物，2000，20（4）：361-366.

[9] 廖海，杜祯，周嘉裕，等.1种利用SDSPAGE检测过氧化物酶同工酶的分析方法[J].安徽农业科学，2008，36（14）：5759-5760，5766.

[10] KIM S J，CHU L，HOLT S C.Isolation and characterization of a heminbinding cell envelope protein from Porphyromonas gingivalis[J].Microb Pathog，1996，21：65-70.

[11] ZELCK U E，BECKER W，BAYNE C J.The plasma protein of Biomphalaria glabrata in the presence and absence of Schistosoma mansoni[J].Dev Comp Immunol，1995，19（3）：181-194.

[12] 王爽，陈卫良.LDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析植物过氧化物酶同工酶[J].植物生理学通讯，2006，42（4）：713-716.

[13] 邱竟，张久绪.棉花雄性不育“三系”过氧化物酶同工酶等电聚焦电泳分析[J].作物学报，1991，17（5）：376-380.

[14] 周楠，溪元龄.关于棉属四倍体种起源问题的过氧化物酶同工酶研究[J].遗传学报，1990，17（4）：294-300.

[15] 徐建龙，童富淡，胡家恕.水稻细菌性条斑病抗性与过氧化物酶同工酶关系的初步研究[J].农业生物技术学报，2000，8（1）：71-75.

[16] 程东升，潘学仁.食用菌过氧化物酶同工酶不同染色法效果比较[J].中国食用菌，1996，18（3）：15-18.

[17] 王秀芬.过氧化物酶同工酶最佳染色法[J].河北农业大学学报，1990，13（4）：78-80.

[18] 刘红燕.鬼针草属六种植物的同工酶电泳实验研究[J].中国野生植物资源，2013，32（2）：26-27.

[19] 赵晓平，荣威恒，刘玲玉，等.5种杨树种间及品种间同工酶的比较分析[J].安徽农业科学，2008，36（6）：2262-2264.

[20] 张春，张以忠，熊源新.几种泥炭藓属植物的过氧化物酶同工酶分析[J].贵州农业科学，2012，40（8）：95-97.

[21] 马玉花，杨春江，宋维秀，等.九种忍冬属植物叶片的过氧化物酶同工酶酶谱分析[J].湖北农业科学，2012，51（15）：3246-3248.

[22] 高勇，杨丽华，徐喜楼，等.苹果树不同器官和组织中过氧化物酶同工酶谱研究[J].落叶果树，1991（3）：15-17.

[23] 全妙华，陈东明，许忠意，等.四棱豆不同节位叶片及各器官过氧化物酶同工酶的分析[J].农业与技术，2006，26（1）：127-129，138.

[24] 孙丹，朴炫春，刁艳玲，等.组培平贝母形态转变过程中过氧化物酶同工酶变化的研究[J].北方园艺，2010（7）：185-187.

[25] 赵沙沙，张海娣，张建垒，等.“黄金冠”桃及其品系亲缘关系分析研究[J].安徽农业科学，2008，36（34）：14944-14945.

[26] 区炳庆，任吉君，何丽烂.过氧化物酶同工酶在南瓜分类中的应用[J].佛山科学技术学院学报：自然科学版，2002，20（3）：45-47.

[27] 张光花，徐玉芳，李春香，等.胡葱与洋葱、葱过氧化物酶同工酶研究及聚类分析[J].植物遗传资源学报，2003，4（1）：47-50.

[28] 夏齐平，余本祺，周守标.基于POD同工酶对石蒜属种间和石蒜居群间进化关系的研究[J].安徽师范大学学报：自然科学版，2011，34（2）：154-158.

[29] 朱友林，刘纪麟.玉米抗大斑病菌基因及其遗传背景与过氧化物酶同工酶关系的研究[J].中国农业科学，1996，29（3）：27-32.

[30] 马峙英，刘叔倩，王省芬，等.过氧化物酶同工酶与棉花黄萎病抗性的相关研究[J].作物学报，2000，26（4）：431-437.

[31] 史学群，宋海超，郑服丛.过氧化物酶、过氧化物酶同工酶、酯酶同工酶与橡胶树抗炭疽病的关系[J].海南大学学报：自然科学版，2002，20（2）：140-144.

[32] 沈光華，许燕，庄薇薇.大麦、油菜的抗耐病性与过氧化物酶同工酶的关系[J].上海师范大学学报：自然科学版，2001，30（3）：52-55.

[33] 周敏，庄东红，郑奕雄.过氧化物酶同工酶技术在花生种子纯度检测中的应用研究[J].花生学报，2001，30（3）：27-29.

[34] 梅德圣，李云昌，陈玉峰，等.用过氧化物酶同工酶和SSR标记鉴定中油杂12种子纯度[J].农业生物技术学报，2010，18（4）：815-821.

[35] 马国斌.应用淀粉凝胶电泳鉴定西甜瓜杂交种纯度的研究[J].种子，2004，30（3）：30-35.

[36] 黄永红，韩明，王延波，等.西瓜杂交种纯度快速检测初探[J].黑龙江农业科学，1994（6）：21-25.

[37] 朱立武，刘童光.杂交西瓜过氧化物酶同工酶分析[J].安徽农学院学报，1992，19（4）：274-278.