补阳还五汤对60Coγ射线辐射损伤小鼠外周血T淋巴细胞亚群和IL-2的影响*

张 炜，韩 彪△，刘喜平，孙少伯

1 兰州大学第一医院，甘肃 兰州 730000；2 兰州大学第一医院；2 甘肃中医学院教育部“敦煌医学与转化”重点实验室；3 甘肃中医学院中西医结合研究所

补阳还五汤对60Coγ射线辐射损伤小鼠外周血T淋巴细胞亚群和IL-2的影响*

张 炜1，韩 彪1△，刘喜平2，孙少伯3

1 兰州大学第一医院，甘肃 兰州 730000；2 兰州大学第一医院；2 甘肃中医学院教育部“敦煌医学与转化”重点实验室；3 甘肃中医学院中西医结合研究所

目的：探讨补阳还五汤对辐射损伤的防护作用及机制。方法：采用60Coγ射线对小鼠进行一次性全身照射致辐射损伤动物模型，观察外周血淋巴细胞亚群CD3+、CD4+、CD8+及白细胞介素-2（IL-2）的变化。结果：于60Coγ射线照射前后，连续14天灌胃补阳还五汤水煎液，可使受辐射小鼠外周血的CD3+和CD4+水平显著上升（P＜0.01），同时可升高血清及脾脏白细胞介素-2（IL-2）水平。结论：补阳还五汤具有明显的抗辐射作用，其机制可能与其能增强机体免疫功能，减轻辐射对机体的损伤，调整免疫系统功能恢复，增强机体对辐射的抵御力有关。

补阳还五汤；60Coγ射线；辐射损伤；小鼠

辐射属中医外邪范畴，具有直中脏腑，耗伤元气的特点，使气虚不能推动血脉运行，致“停血留瘀”，形成“气虚血瘀”的病理机制［1-2］，故益气活血法为防治辐射后机体损伤或毒副反应的关键治法。补阳还五汤为益气活血法的代表方剂，本研究发现益气活血法对60Coγ射线辐射损伤小鼠外周血T淋巴细胞亚群和白细胞介素-2（IL-2）有明显影响，现将实验结果报道如下：

1 材料与方法

1.1 动物 SPF级昆明种小鼠，雌雄各半，体质量（20～25）g。由甘肃中医学院科研实验中心提供，并在甘肃中医学院实验动物中心SPF级实验室饲养。实验设施证号：SYXK（甘）2004-0006，实验动物质量合格证号：SCXK（甘）2004-0006。

1.2 药物及试剂 补阳还五汤药材购自兰州大学第一医院中药房，经甘肃中医学院中药鉴定教研室鉴定符合药典标准。按原方组成及比例混合［3］，将各组药物饮片浸泡30分钟，煎煮2次，30min/次，纱布粗滤去渣，2煎混匀，药液浓缩为含生药0.5g/mL，置于冰箱保存备用；EDTA-K2抗凝剂（天津市科密欧化学试剂开发中心，批号：20110218）；Mouse CD3试剂盒（Invitrogen，Carisbad，CA9200 USA，批号：286157D）；Mouse CD4试剂盒（北京福瑞生物工程公司，批号：20110801）；Mouse CD8试剂盒（西安舟鼎国生物技术有限公司，批号：20080817）；Mouse白细胞介素2（IL-2）定量检测（E1isa）试剂盒（西安舟鼎国生物技术有限公司，批号：20120896）。

1.3 仪器 照射装置，采用60Coγ射线源（兰州大学第一医院放疗科钴源室GWGP80型60Coγ治疗机）；流式细胞仪（Beckman co1ter XL）；Biorad S680酶标仪（E1isa kit博士德）；CO2培养箱（美国Forma公司生产）。

1.4 方法

1.4.1 动物分组及给药 选用SPF级昆明种小鼠75只，雌雄各半，随机分为5组，每组15只，组间无差异（P＞0.05）。N组（正常组）：不灌胃，不照射，食水自由；R组（照射组）：小鼠在自由活动状态下，采用60Coγ射线进行全身辐射1次，辐射条件为等效方野20cm×20cm面积，焦点-鼠距80cm，1Gy/min增量，辐照6分钟，总剂量为6 Gy；BL组（低剂量补阳还五汤保护组），按照1g/kg（相当于人剂量的5倍）剂量灌胃；BM组（中剂量补阳还五汤保护组），按2g/kg（相当于人剂量的10倍）剂量灌胃；BH组（高剂量补阳还五汤保护组），按4g/kg（相当于人剂量的20倍）剂量灌胃。补阳还五汤各保护组连续灌胃14天，于给药后第6天进行辐射，辐射方法同照射组。

1.4.2 辐射损伤小鼠外周血T淋巴细胞含量的检测 于第15天各组小鼠眼底采血，肝素钠抗凝，100μL全血加CD3+、CD4+、CD8+抗体各10μL，轻轻吹匀后，避光，室温温育30分钟，加1mL红细胞裂解液，1 000r/min，离心5分钟，弃上清液，用1mL 0.001 M的PBS重新悬浮细胞，200目过滤网过滤样本后上机检测，按照小鼠CD3+、CD4+、CD8+试剂盒说明，流式细胞仪检测，上样分析。

1.4.3 辐射损伤小鼠血清及鼠脾脏IL-2水平的检测 于第15天各组小鼠眼底采血，离心20分钟（2 000r/min），取血清，备用。颈椎脱臼处死动物，摘取小鼠脾脏，除尽脂肪等组织，制备成5×106/mL脾细胞混悬液，加入ConA，使终浓度为5μg/mL，置37℃，5％CO2培养箱中培养24小时，收集细胞，取出离心20分钟（2 500r/min）洗涤2次，收集上清液，灭菌后-20℃冰箱保存备用。以上血清及脾细胞上清液均采用ELISA试剂盒，按说明书双抗体夹心法检测IL-2的含量。

1.5 统计学方法 数据采用SPSS 11.5软件进行统计分析，组间均数比较采用t检验，检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 补阳还五汤对辐射损伤小鼠外周血淋巴细胞亚群的影响 小鼠受辐射损伤后，外周血CD3+、CD4+、CD8+较正常组均有显著下降，与正常组比较有明显差异（P＜0.01），但下降幅度有所不同，其中CD3+的降低幅度最大，照射组CD4+/CD8+比值较正常组明显升高（P＜0.01）；补阳还五汤各剂量组对CD8+的作用不明显，但均可使受辐射小鼠的CD3+和CD4+水平较照射组显著上升，与照射组比较有显著差异（P＜0.05）；补阳还五汤各剂量组对CD4+/CD8+无明显影响（P＞0.05），见表1。

表1 补阳还五汤对辐射损伤小鼠外周血淋巴细胞亚群的影响（±s）

表1 补阳还五汤对辐射损伤小鼠外周血淋巴细胞亚群的影响（±s）

注：与N组比较▲表示P＜0.01；与R组比较△表示P＜0.01，△△表示P＜0.05。

组别 例数 CD3+/％ CD4+/％ CD8+/％ CD4+/CD8+N 15 31.10±2.20 11.30±2.20 4.78±3.10＊ 2.36±0.01 R 15 6.67±3.10▲ 9.24±4.20▲ 2.38±5.80▲ 3.88±0.04▲BL 15 8.16±1.90△ 9.23±2.20 2.48±4.10 3.72±0.07 BM 15 10.20±3.60△ 9.38±4.60△△ 2.96±3.30△△ 3.16±0.06 BH 15 17.20±5.40△ 10.70±5.10△ 3.10±2.80△ 3.45±0.02

2.2 补阳还五汤对辐射损伤小鼠脾脏及血清IL-2水平的影响 小鼠受辐射损伤后，脾脏IL-2显著下降，与正常组比较有明显差异（P＜0.05）；补阳还五汤各剂量组均可升高IL-2水平，且大剂量组作用显著（P＜0.05），见表2。

表2 补阳还五汤对辐射损伤小鼠脾脏及血清IL-2水平的影响（±s） pg/mL

表2 补阳还五汤对辐射损伤小鼠脾脏及血清IL-2水平的影响（±s） pg/mL

注：与N组比较▲表示P＜0.01；与R组比较△表示P＜0.01，△△表示P＜0.05。

组别 例数 IL-2（血清） IL-2（脾脏） N 15 4.361±0.614 0.094±0.053 R 15 3.182±0.440▲ 0.086±0.032▲BL 15 3.520±0.578 0.091±0.026 BM 15 3.760±0.361 0.098±0.017△△BH 15 3.950±0.421 1.067±0.023△

3 讨论

“气虚血瘀”贯穿辐射发病的始终，具有程度不同、轻重不同的特点。故益气活血法是防治辐射后机体损伤或毒副反应的重要治法。补阳还五汤来源于清代医家王清任的《医林改错》，该方重用黄芪为君药，为益气活血法的代表方剂。

辐射对免疫器官以及其他组织、细胞都有损害，但免疫系统对辐射损伤的敏感性最高。淋巴细胞是存在于体内的一种单核细胞，是机体免疫系统的主要构成成分之一。机体受到辐射后，将发生严重的免疫功能低下，表现为免疫活性细胞数量减少，抗体形成抑制或紊乱，细胞因子网络调节失常等。T淋巴细胞主要介导细胞免疫，作为体内最重要的免疫活性细胞之一，对辐射相当敏感，其中T淋巴细胞功能亚群CD3+、CD4+、CD8+在急性辐射损伤后的改变，已经引起学者的高度重视，可作为辐射损伤后反映免疫功能状态的较理想的指标［4］。CD3+代表外周血总T细胞，CD4+代表辅助性T细胞（Th），在免疫反应中发挥调节作用，CD8+代表抑制性T细胞（Ts），能抑制细胞免疫反应，阻止抗体的产生。实验结果显示，60Coγ射线照射后，小鼠外周血CD3+、CD4+、CD8+均有显著下降，与文献报道的基本一致［5］，其中CD3+的降低幅度最大；补阳还五汤各组，尤其是高剂量组可升高受辐射小鼠外周血CD3+和CD4+水平，而对CD8+的作用不明显；补阳还五汤各剂量组对CD4+/CD8+无明显影响。提示补阳还五汤通过介导细胞免疫，发挥免疫调节作用的机理关键在于升高CD3+和CD4+水平。IL-2是T细胞功能增强的重要标志之一，是参与免疫应答和免疫调节的重要细胞因子，可作用于活化的T细胞以促进其增殖。补阳还五汤可明显促进小鼠脾脏产生IL-2的水平，对T淋巴细胞有直接促进作用，或作用于巨噬细胞促进T淋巴细胞的产生，从而促进T淋巴细胞产生细胞因子，促进T淋巴细胞及IL-2的产生。初步实验结果提示，倘若能通过观察调节抗原提呈细胞的功能（促进或抑制）进而观察调节T淋巴细胞的免疫反应功能，也许是一条有效的观察免疫调节和药物发现的新途径［6］。

补阳还五汤中黄芪、当归、川芎等单味药物具有抗肿瘤、调节免疫、抗辐射的药理作用［7-13］，本研究显示补阳还五汤对机体辐射损伤免疫功能具有重要调节作用，初步印证了益气活血法防治辐射损伤的正确性，而对于补阳还五汤的其他抗辐射作用及其机制、有效物质、尤其是药物配伍后的协同增效情况，还有待进一步研究。

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The Influence of BuYang HuanWu Tang on T Lymphocytes and IL-2 in Peripheral Blood of Mice Damaged by60Co γ Ray Radiation

ZHANG Wei1，HAN Biao1△，LIU Xiping2，SUN Shaobo3
1 Lanzhou University the First Hospital，Lanzhou 73000，China；2 Key Laboratory of Education Ministry″Dunhuang Medicine and Translation″from Gansu University of Traditional Chinese Medicine；3 Institute of Integrative Medicine of Gansu University of Traditional Chinese Medicine；

Objective：To explore the protection and the mechanism of BuYang HuanWu Tang for radiation damage.Methods：Animal model was established through60Coγ ray total body radiation once.The changes of interleukin-2（IL-2）and T lymphocytes in peripheral blood including CD3+，CD4+，CD8+were observed.Results：Before and after60Coγ ray radiation，BuYang HuanWu Tang was given by intragastric administration for 14 days，which could make the levels of CD3+and CD4+rise in peripheral blood of the mice significantly（P＜0.01），and raise the level of IL-2 in the serum and the spleen.Conclusion：BuYang HuanWu Tang is effective in protecting the mice with radiation damage，and the mechanism might be related to enhancing immunologic function of the body，relieving the damage caused by radiation of the body，regulating functional recovery of immunologic function and improving animal resistance to the radiation.

BuYang HuanWu Tang；60Coγ ray；damaged by radiation；mice

R392.12

A

1004-6852（2014）01-0017-03

2013-04-27

甘肃省中医药科研项目（编号GZK-2011-79）

张炜（1977—），男，硕士研究生，主治医师。研究方向：心胸外科疾病的中西医结合诊治。

△通讯作者：韩彪（1966—），男，硕士研究生导师，教授。研究方向：胸外科疾病的诊治。