中央空调系统过滤器表面真菌鉴定及温热控制

付柏淋,吕 阳(大连理工大学建设工程学部,建筑环境与新能源研究所,辽宁 大连 116023)

中央空调系统过滤器表面真菌鉴定及温热控制

付柏淋,吕 阳*(大连理工大学建设工程学部,建筑环境与新能源研究所,辽宁 大连 116023)

为研究中央空调系统真菌繁殖扩散机理及控制空气微生物污染问题,通过温热控制手段,探究不同温热环境下真菌菌落、菌丝生长繁殖规律.以某体育馆中央空调系统过滤器表面真菌为研究对象,通过分离、生理生化实验和分子生物学鉴定确认空调系统过滤器表面的优势菌属种类及数量.对分离鉴定的优势菌属做温热控制实验,分别在25℃恒温及22℃～28℃变温条件下观察菌落和菌丝的生长规律.结果显示,该空调系统过滤器表面真菌优势菌属为青霉属(Penicillium spp.)和枝孢属(Cladosporium spp.),菌落形成单位分别为600, 140cfu/c m2.温热控制研究表明,无论25℃恒温或22～28℃变温条件,青霉属生长速度都要快于枝孢菌,且菌落直径变化和时间成线性关系;温热控制对青霉属和枝孢菌的生长繁殖具有明显的抑制作用,温热控制技术在抑制空调系统真菌生长上可行.

中央空调系统；过滤器；真菌；分离鉴定；温热控制

随着经济发展及建筑舒适性要求的提高,大量居住建筑及公共建筑使用空调系统来满足室内温湿度的要求.而在空调系统内部,过滤器、冷却盘管、冷凝水积水盘、加湿器等位置都为细菌、真菌等微生物提供了极佳的繁殖环境[1-5].这些繁殖的微生物,通过空调系统进入室内后,会对暴露在室内环境中的人群健康造成危害[6-8].多项医学研究表明,真菌污染与哮喘、过敏性鼻炎及呼吸道感染有关[9].法国国家卫生与医学研究所研究表明,室内真菌对严重哮喘患者的危害性是相对于其他过敏物质的2倍[10]. Somers等[11]发现吸入污染真菌颗粒的小鼠基因发生突变,这为真菌导致癌变提供了间接证明.同样,真菌孢子极易扩散的特性也决定其危害程度,尤其当空调系统风机运行后极易将真菌及其孢子扩散到室内,造成生物污染[12].

2004年卫生部对全国近1000家宾馆、商场等公共场所的中央空调系统进行抽检,微生物合格率仅为6%,其中近50%为重度污染[13].广州于2007年抽查5家公共场所空调系统,细菌总数检出范围27～930cfu/cm3,真菌总数检出范围7～6000cfu/cm3,依据《公共场所集中空调通风系统卫生规范》,送风中的细菌总数≤500cfu/cm3,真菌总数≤500cfu/cm3,细菌、真菌合格率均值分别为71.4%和85.7%[14].2012年大连市抽查10家酒店及宾馆,依据卫生规范细菌、真菌合格率均值分别为78.3%和77.8%,虽然卫生状况有所改善,但风管内的真菌含量仍超标数倍[15].

而在空调系统易滋生的微生物中,真菌存在比例又相对较高.陈凤娜等[16]对国内12个省份或直辖市的空调系统调查表明,空调系统内真菌总数是细菌总数的4.49～25.19倍.李安桂等[17]对陕西历史博物馆空调系统实测研究表明,空调系统各段中真菌浓度是细菌浓度的1.60～128.06倍.卢振等[18]对哈尔滨两栋大型公共建筑实测研究表明,空调设备表面平均浓度真菌是细菌的4.7倍.

综上所述,研究中央空调系统真菌类微生物生长繁殖特性,并找到合适有效的控制方法极其重要.本研究通过对某体育馆中央空调系统过滤器表面真菌类微生物鉴定分析,分离得出过滤器表面真菌类微生物优势菌属,并通过温热响应实验对其生长繁殖规律进行研究,以期为使用温热控制手段解决空气微生物污染问题提供资料.

1 材料与方法

1.1 实测仪器与材料

无菌无纺布(100mm×100mm)、蒸馏水、察氏培养基(蔗糖30g/L,硝酸钠3g/L,磷酸氢二钾1g/L,硫酸镁0.5g/L,氯化钾0.5g/L,硫酸亚铁0.01g/L, 121 ℃灭菌20min后使用)、载玻片、盖玻片、凡士林、恒温培养箱、双向调节温度的培养摇床、高压灭菌锅、电子显微镜,TR-72i温湿度自记仪等.

1.2 真菌的采样与计数

选取某体育馆中央空调系统作为实测对象,在空调系统过滤网上,用镊子夹取无菌无纺布在5cm×5cm的区域上轻拭,采集该区域内全部积尘后将无纺布装入灭菌袋.在无菌操作间,将擦拭物加入到无菌水中做充分清洗,使无菌无纺布上的物质完全溶于无菌水,制成菌原液.取原液,分别制备10倍、100倍梯级稀释浓度的菌液.分别吸取3种不同浓度的溶液1mL,滴在培养基上.将培养基放置在28℃培养箱中48h后,观察优势菌属菌落数.平行样菌落数取平均值,优势菌属1,菌落数为600cfu/cm²,优势菌属2,菌落数为140cfu/cm².

1.3 优势菌属的分离鉴定

1.3.1 生理生化实验 菌落培养成型后,通过菌落表面特性及菌丝结构,结合《菌种鉴定手册》[19]进行初步判断.从菌落形态、颜色等生理生化特征,可见优势菌属1(图1)特征为菌落空气侧白色、成絮状;平板侧菌落成翠绿色,有金色斑点.在40倍显微镜下观察菌丝及孢子结构,可见菌丝有隔膜、多核,菌丝体产生掃状分支的分生孢子梗,分生孢子为椭圆无隔孢子.优势菌属2(图2)特征为菌落空气侧黑色,较平坦;菌丝有隔多核,具有足的结构.

图1 青霉属Fig.1 Penicillium spp.

图2 枝孢属Fig.2 Cladosporium spp.

图3 青霉属系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of Penicillium spp.

图4 枝孢属系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree of Cladosporium spp.

1.3.2 分子生物学鉴定 挑取平板上从过滤网上分离出的优势真菌,分别置于4份液体察氏培养基中,在28℃、150r/min下培养3～4d,直至培养基中出现明显菌丝球.培养完成后,进行基因组提取.待基因组样品提取完成,将样品保存于-20℃,进行PCR扩增18S rDNA片段及纯化,PCR扩增产物于1%琼脂糖凝胶上电泳,在紫外线灯下切下含目的片段凝胶,用DNA胶回收试剂盒回收目的片段,将目的片段DNA与T-载体连接,置于16℃反应12h以上.反应后进行转化克隆和筛选阳性克隆,用质粒提取试剂盒提取质粒.通过双酶切法(EcoR I, Hind III)验证,将含18S rDNA的质粒测序.将测序结果使用NCBI BLAST软件和GenBank数据库进行同源性分析,并建立系统发育树.经18S rDNA测序和同源性比较,真菌1与多株Penicillium spp. 18S rDNA的相似性水平达到99%,其系统发育树如图3所示(图3中真菌1表示为G7).生理生化判断及分子生物学鉴定真菌1为青霉属(Penicillium spp.);真菌2与多株Cladosporium spp. 18S rDNA的相似性水平达到99%,其系统发育树如图4所示(图4中真菌2表示为B7).生理生化判断及分子生物学鉴定,真菌2为枝孢属(Cladosporium spp.).

2 结果

2.1 实验方案

为研究空调系统过滤器表面真菌类微生物在不同温度下的生长规律,进行了恒温培养和变温培养.恒温培养下(Case-1),环境温度设定为25℃,每12h记录1次菌落直径;变温培养下(Case-2),环境温度设定变化范围是22～28℃,每12h将22℃和28℃互换1次并记录菌落直径.实验方案如图5所示.所有实验经过凡士林滴加蒸馏水保湿处理,相对湿度维持在恒定值90%.

图5 实验方案示意Fig.5 Experimental program

2.2 实验结果

由图6和图7可见,无论是恒温环境或是变温环境,青霉属和枝孢属的菌落直径均随时间延长而繁殖扩大,但两株真菌的增长速度和增长形态却表现各异.在恒温条件下(图6),青霉属的菌落生长速率大于枝孢属.在变温条件下(图7),青霉属相对于枝孢属,真菌孢子极易扩散.

由图8可知,在恒温环境下随着时间的推移,两株真菌菌落直径增殖速率成线性变化,且青霉属的菌落生长速度要远大于枝孢属.可见,在恒温条件下两株优势真菌呈自然增殖状态.

图6 25℃恒温真菌菌落变化Fig.6 Time series of fungal colonies at constant temperature of 25℃

图7 22～28℃变温两株真菌菌落变化Fig.7 Time series of fungal colonies at variable temperature ranging from 22℃ to 28℃

图8 25℃恒温真菌生长曲线Fig.8 Growth curve of two fungi at constant temperature of 25℃

由图9可见, 22～28℃变温环境下,随着时间的推移,青霉属于培养108h左右出现了缓慢生长至不再生长的情况,之后菌落直径未再发生变化;枝孢属在培养180h后也出现平缓生长的倾向.在变温环境下,青霉属比枝孢属提前出现了生长停滞,温热响应较迅速.相对于恒温环境,两株真菌都较早出现了生长停滞.可见,在变温条件下两株优势真菌呈受控状态.

图9 22～28℃变温真菌生长曲线Fig.9 Growth curve of two fungi at variable temperature ranging from 22℃ to 28℃

3 讨论

3.1 不同菌株在相同温度环境下生长特性分析

对比图8和图9可知,在25℃恒温环境培养下,青霉属和枝孢属两株真菌都以一定的生长速度增殖,且一周后生长速度仍未出现放缓的趋势,菌落直径与时间成线性关系.可见,稳定的温度有利于真菌生长;在22～28℃变温环境培养下,两株优势菌属的生长速度变化率降低,生长速度稳定性也不如25℃恒温环境下,青霉属与枝孢属的生长都受到抑制.并且,在22～28℃变温下青霉属的孢子更易扩散(图7A),推断这与温度变化有关.

3.2 相同菌株在不同温度环境下生长特性分析

由图8和图9可知,在恒温环境下,青霉属快速生长;但在变温环境下,经过96h后,青霉属的生长明显受到抑制,108h后青霉属菌落不再变化.在恒温环境下,枝孢属的生长速度要快于变温环境.在变温环境下,经过180h后,枝孢属的生长均有受到抑制的倾向.由此可见,温热控制对青霉属的生长具有明显抑制作用,对枝孢属也有此倾向.

3.3 青霉属和枝孢属的菌落直径变化分析

由表1可知,在恒温和变温环境下,192h后青霉属菌落直径分别达到36mm和24mm,而枝孢属菌落直径只能达到21mm和16mm.由此可知,无论在何种环境下,真菌种类特性的不同决定了青霉属的生长速度均快于枝孢属,温热控制不能改变菌种这一特性.但对于同一菌株,无论是青霉属还是枝孢属,在变温环境下菌落的增殖速率均要落后于恒温环境,由此可见,通过温热控制可以抑制真菌增长.

表1 不同环境下两株真菌直径变化(mm)Table 1 Change of two fungal diameter in different environment (mm)

4 结论

4.1 经生理生化实验和分子生物学鉴定,本研究中央空调系统过滤器表面真菌类微生物优势菌属为青霉属(Penicillium spp.)和枝孢属(Cladosporium spp.),菌落数分别为600cfu/cm2和140cfu/cm2.

4.2 无论恒温25℃或变温22～28℃条件,青霉属生长速度都要快于枝孢属,这是温热控制所不能改变的.

4.3 通过恒温和变温实验对比发现,无论是青霉属还是枝孢属,在变温环境下菌落的生长速度变化率均要落后于恒温环境,这一作用对青霉属的生长更加明显,对枝孢属也有此倾向,可以通过温控抑制某些菌属的真菌繁殖.

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致谢：研究得到大连理工大学生命科学与技术学院包永明教授、袁文杰副教授大力支持,在此向所有相关研究人员表示感谢.

Identification and thermal control on fungi from the filter of central air conditioning system.

FU Bai-lin, LÜ Yang*(Laboratory of Building Environment and New Energy Resource, Department of Building Engineering, Dalian University of Technology, Dalian 116023, China). China Environmental Science, 2014,34(11)：2917～2921

To explore the propagative and diffused mechanism of fungi in central air conditioning system and control air microorganism contamination problem, growth rhythms of fungal colony and mycelium were researched in different thermal environments by thermal control. Fungi separated from the filter surface of the central air conditioning system in a gym were chosen as the research objects. By isolation, physiology and biochemistry experiments, and molecular biological identification, dominant fungi on the filter of central air conditioning system were confirmed. In order to conduct thermal control experiment of separated dominant fungi, growth rhythms of fungal colony and mycelium were observed at temperature of 25℃ and 22～28℃, respectively. As a result, it was shown that the dominant fungi were Penicillium spp. and Cladosporium spp., colonies were 600 and 140 cfu/cm2respectively. It was indicated that regardless of constant or variable temperature conditions, the reproduction rate of Penicillium spp. was faster than Cladosporium spp., with a liner correlation between colony diameter and time. Penicillium spp. and Cladosporium spp were obviously restrained by temperature change control. Thermal control was feasible for restraining fungal growth in air conditioning system.

central air conditioning system；filter；fungi；isolation and identification；thermal control

X172

A

1000-6923(2014)11-2917-05

付柏淋(1988-),男,辽宁大连人,大连理工大学硕士研究生,主要从事室内空气品质研究.

2014-02-17

国家自然科学基金资助项目(51308088);高等学校博士点专项基金(20120041120003);北京市重点实验室研究基金(NR2013K05);大连理工大学基本科研业务费专项(DUT14QY24).

* 责任作者, 副教授, lvyang@dlut.edu.cn