MBR系统CANON工艺的快速启动及微生物种群特征

李 冬,何永平,张肖静,梁瑜海,张玉龙,范 丹(.北京工业大学水质科学与水环境恢复工程北京市重点实验室,北京 004；.哈尔滨工业大学城市水资源与水环境国家重点实验室,黑龙江 哈尔滨 50090)

MBR系统CANON工艺的快速启动及微生物种群特征

李 冬1*,何永平1,张肖静2,梁瑜海1,张玉龙1,范 丹1(1.北京工业大学水质科学与水环境恢复工程北京市重点实验室,北京 100124；2.哈尔滨工业大学城市水资源与水环境国家重点实验室,黑龙江 哈尔滨 150090)

为了考察CANON工艺的快速启动策略及功能微生物的种群特征,在常温MBR反应器内接种普通活性污泥后间歇运行.启动策略为以调控曝气时间和曝气量作为主要方法,首先在限氧条件下启动亚硝化,之后进一步降低DO启动CANON工艺.在CANON工艺启动成功后,通过调整曝气时间和无机碳源浓度提高了总氮去除负荷,并采用PCR-DGGE技术分析了稳定运行的CANON工艺内功能微生物的种群特征.结果表明,CANON工艺经36d成功启动,NH4+-N去除率和总氮去除率最终稳定在99%和84%左右,氮去除负荷达到0.41kg/(m3·d).DGGE测序结果表明,Nitrosomonas和Candidatus Kuenenia stuttgartiensis是反应器内的优势菌种,两种微生物协同作用,共同在MBR内完成了高效的自养脱氮.

MBR；普通活性污泥；CANON；启动；PCR-DGGE；微生物

基于亚硝化的全程自养脱氮(CANON)工艺具有脱氮效率高、耗氧量低、无需外加碳源且污泥产量低、经济环保等优点,是近年来受到广泛关注的一种新型生物脱氮工艺.在CANON工艺中,氨氧化菌(AOB)在限氧条件下,以氧作为电子受体将部分NH4+-N氧化为NO2--N,厌氧氨氧化(Anammox)菌以AOB产生的NO2--N为电子受体,与剩余NH4+-N反应,生成N2并释放,达到脱氮目的.

现阶段对CANON工艺的研究多在生物滤柱[1]或SBR[2-3]中进行.但生物滤柱多采用火山岩等硬性填料,造成其堵塞问题一直无法有效解决,而SBR污泥易流失,导致生物量减少,去除负荷低,且由于AOB和Anammox菌均是自养菌,生长缓慢,尤其是Anammox菌,倍增时间为11d[4],导致CANON工艺启动时间长.因此寻找合适的反应器类型对CANON工艺的启动及稳定运行意义重大.膜生物反应器(MBR)依靠膜渗透原理,将所有微生物截留在反应器内部,可防止污泥流失,提高反应器内生物浓度,特别适用于AOB菌和Anammox菌这类生长缓慢,倍增时间长的微生物生长.因此,若将MBR应用于CANON工艺可以有效解决污泥流失,处理负荷低等问题,从而加快启动时间.

目前,国内外关于CANON工艺的接种污泥多采用具有亚硝化或厌氧氨氧化活性的特种污泥[5-8],而这些污泥相对稀缺,不易获得且价格昂贵,相比之下普通活性污泥分布广泛,容易得到且价格低廉.可见,若能以普通活性污泥为种泥来启动CANON,可以说是为该工艺的启动提供了既方便又经济的污泥源.

因此,本研究在常温条件下,接种普通活性污泥,采用MBR反应器,以间歇运行方式启动CANON,同时通过PCR-DGGE、克隆等分子生物学技术研究反应器内功能微生物的种群特征,以期为缩短CANON工艺的启动时间和微生物特性提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 试验装置

试验装置采用有机玻璃制成的圆柱形MBR反应器,如图1所示.圆柱内径13cm,高度40cm,有效容积3L,内置聚偏氟乙烯(PVDF)中空纤维膜组件,膜孔径为0.1μm,有效膜面积为0.2m2,膜通量36L/h.反应器底部设置曝气环,采用鼓风曝气,曝气量由转子流量计控制,中间设有搅拌机,用于基质和O2均匀扩散,外部设置水浴套筒,由温度控制仪控制反应器内温度.

1.2 接种污泥

试验接种污泥取自北京市某污水处理厂普通活性污泥.接种前,污泥先经自来水和蒸馏水各清洗3遍,去除其中的杂质,之后接种至MBR反应器内.接种时MLSS为12.9g/L,MLVSS为10.6g/L,接种量为1L.

图1 试验装置示意Fig.1 Schematic of the experimental reactor

1.3 试验用水与试验方法

试验用水采用人工配水,分别以(NH4)2SO4和NaHCO3作为NH4+-N和碱度的来源,NH4+-N浓度和碱度固定不变.进水中额外添加MgSO4·5H2O、CaCl2、KH2PO4和营养液Ⅰ、Ⅱ作为营养物质,营养液Ⅰ包括EDTA 5000mg/L和FeSO45000mg/L．营养液Ⅱ(mg/L)包括EDTA 15000、ZnSO4·7H2O 430、CoCl2·6H2O 240、MnCl2·4H2O 990、CuSO4·5H2O 250、Na2MoO4· 2H2O 220、NiCl2·6H2O 190、Na2SeO4·10H2O 210和H3BO414.试验用水水质见表1.

表1 试验用水水质Table 1 Key water quality of the influent

试验在常温下(23～25℃)采用间歇运行方式,每个周期包括:瞬时进水,曝气反应,曝气完成后,膜抽吸出水.换水比83.3%,一个周期完成后进入下一个周期.CANON工艺的启动采用先启动亚硝化富集AOB,再限氧富集Anammox,启动CANON.试验主要分为3个阶段:阶段Ⅰ,亚硝化启动;阶段Ⅱ, CANON工艺启动;阶段Ⅲ,CANON工艺负荷提高.不同阶段主要运行条件见表2.

表2 不同阶段主要运行条件Table 2 Operation conditions at different stages

1.4 分析项目与方法

NH4+-N、NO2--N、NO3--N、MLSS、MLVSS等指标均采用国家规定的标准方法测定[9]; NO2--N积累率(NAR)可按式(1)计算;DO、pH值及温度测定分别采用EUTECH DO2000PPG多功能溶解氧在线测定仪,WTW pH296 型在线测定仪.

式中:[NO2--N]eff为出水NO2--N浓度; [NO3--N]eff为出水NO3--N浓度.

1.5 DNA提取,PCR-DGGE,克隆和测序

1.5.1 基因组DNA的提取 在CANON工艺的稳定期,从MBR反应器内采集混合液.用UNIQ-10柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒(上海生工)提取基因组DNA,具体操作按说明书进行.所提取的基因组DNA用0.8wt%(质量分数)的琼脂糖凝胶电泳检测,以备PCR用.

1.5.2 PCR扩增及DGGE电泳 采用巢式PCR方法,分别扩增β-proteobacteria菌门的AOB, Planctomycetales菌门的Anammox菌.为扩增AOB的16S rDNA,第一轮扩增使用CTO189fA/B和CTO189fC混合引物(体积比2:1)作为正向引物,反向引物采用CTO654r.之后以第一轮PCR扩增产物为模板,使用通用引物对F338(带GC夹)/R518,进行第二轮PCR扩增.对于Anammox菌的特异性片段的扩增,第一轮先以引物对Pla46F/630R进行浮霉球菌扩增.之后以第一轮PCR扩增产物为模板,使用引物对Amx368f(带GC夹)/Amx820r,进行第二轮PCR扩增.PCR 反应体系为25μL,其中包含2.5μL 10×Ex Taq buffer (Mg2+Plus ),2.0μL DNTP,1.0μL BSA,1.0μL引物,0.125μL, TaKaRa Ex Taq酶,模板DNA约1.0ng,用无菌水补齐至25μL.引物碱基序列及反应条件见表3.

表3 PCR常用引物对应程序Table 3 Corresponding programs of commonly used PCR primers

PCR扩增产物用1.5wt%的琼脂糖凝胶进行电泳检测.采用Sanprep柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工)进行PCR 产物的纯化回收,具体操作按说明书进行.对PCR产物进行DGGE 分析:聚丙烯酰胺质量分数8wt%,变性梯度为30%～60%,电压120V,电泳时间5h,电泳在Dcode Universal MutationDetection System仪器上进行.电泳结束后按Bassam等[14]的方法对凝胶进行银染,并对凝胶拍照.

1.5.3 克隆和测序 切取DGGE 图谱中的目的条带溶于150μL T E(pH 8.0)溶液中,4℃过夜,以此为模板,以不含GC夹的引物进行PCR扩增,并对PCR 产物进行纯化.按照pMD19-T plasmid vector system说明书进行基因片段与载体的连接后,转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中,通过蓝白斑法筛选阳性克隆子,过夜培养后并进行测序.采用BLAST对测序结果和基因库中已知序列进行相似性分析.并将所获得的序列提交至Gentbank,授权序列号为:KF171345～KF171352 (AOB),KF442618～KF442619(Anammox).

2 结果与讨论

2.1 亚硝化的启动及稳定运行

亚硝化的实现是成功启动CANON的基础,该阶段的目的是富集AOB并抑制NOB的活性.此阶段,以限氧方式启动亚硝化,初始进水NH4+-N浓度为200mg/L,曝气量为0.3L/min, DO为0.3mg/L, 曝气时间为5h.由图2可见,在第1d,反应器内就有NO2--N积累,这说明在限氧反应器内,NOB的活性就已经受到抑制,不能及时氧化NO2--N,从而造成了NO2--N积累,NAR在30%左右.在前6d, NAR整体呈上升趋势,第6d NAR达到50%左右,认为亚硝化启动成功.但是在第5d,第6d, NH4+-N去除率(ARR)有所波动且较低,所以第7d曝气时间由原来的5h延长为7h,使更多的NH4+-N被氧化,提高ARR.曝气时间延长后,DO为0.3mg/L,ARR提高并持续上升,到第25d达到70%左右,此后至第30d稳定在75%左右.NAR也一直升高,最终稳定在90%左右,总氮去除率(TNR)维持在2%(总氮损失造成).因为启动亚硝化的目的是为了启动CANON,因此NAR无需上升并稳定在95%以上.而且,ARR也没有必要达到100%,反应器内留有NH4+-N既可以抑制NOB[15]还可以为Anammox菌快速提供基质.

亚硝化快速启动并稳定运行的主要原因是:①DO控制得当.AOB氧饱和常数为(0.2～0.4)mg/L,NOB 为(1.2～1.5)mg/L[16],本研究中DO控制在0.3mg/L,有效的抑制了NOB的活性.②残留NH4+-N的影响.反应器内一直残留部分NH4+-N,也可以抑制NOB的活性.从而使AOB快速富集,成功启动了亚硝化.

图2 阶段Ⅰ反应器运行性能Fig.2 Performance of the reactor during stageⅠ

2.2 CANON工艺的启动及稳定运行

反应器运行至第31d,降低DO,启动CANON.曝气量由0.3L/min下降到0.2L/min, DO为0.15～0.2mg/L,曝气时间延长为9h.从图3可知,此阶段ARR在经过3d的平缓期后持续上升并稳定在80%左右,NAR下降并稳定在73%左右,反应器内开始出现明显的总氮损失现象,TNR和氮去除负荷(NRR)最高分别为35%和0.22kg/(m3·d).由图3可知,出水NO2--N浓度急剧下降,而出水NO3--N浓度增长却较缓慢,说明减少的NO2--N并没有全部被NOB氧化为NO3--N,并且出水NH4+-N浓度不断减小,推测反应器内发生了厌氧氨氧化反应,Anammox菌将NH4+-N和NO2--N转化为少量NO3--N和N2,导致出水NH4+-N和NO2--N浓度同时下降,出水NO3--N浓度轻微上升.此外,总氮开始有损失,TNR不断上升,而配水中不含有机物,总氮损失不可能是由反硝化细菌造成的,并且ΔNO3--N/ΔNH4+-N已接近于0.11,更进一步论证了反应器内发生了Anammox反应,建立了CANON工艺.同时2.4节中DGGE图谱结果也证实此阶段AOB菌和Anammox菌共存于反应器内.降低DO后,仅经过1d就出现了氮去除现象,说明前期活性污泥中含有Anammox菌,之所以没有表现活性,是受外界条件(基质、DO等)和自身的影响.Strous等[17]的研究表明Anammox菌细胞浓度>1010～1011个/mL时活性才能显现出来.本研究中,调节DO后,Anammox菌立即显现出来.同时ARR和TNR在31～34d较后面几天增势缓慢,说明CANON启动初期,Anammox菌活性较低,随着反应的进行,Anammox菌逐渐适应,后期活性不断提高.在第36d时,NRR达到0.1kg/(m3·d)以上,认为CANON工艺启动成功,图中显示,本研究在常温下仅经历36d就完成了MBR内CANON工艺的启动.相比于国内外其他研究,本研究仅接种普通活性污泥,就能在短时间成功启动CANON,说明利用MBR反应器可以缩短CANON工艺的启动时间(表4).

CANON工艺快速启动的原因分析如下:①反应器内较低的DO,在保证AOB需氧量的前提下,低DO会有效抑制NOB,并且对Anammox菌的影响较小,有利于富集AOB和Anammox菌;②较高的NH4+-N浓度有利于AOB和Anammox菌的生长,同时亚硝化启动后,残存的NH4+-N及生成的NO2--N也会诱导Anammox菌的活性;③由于膜的抽吸作用,使膜丝表面附着少量活性污泥逐渐形成泥饼层且由于氧传质限制,在泥饼层内部会形成局部缺氧微环境,有利于Anammox菌的生长繁殖;④因MBR反应器能有效的进行固液分离,将全部污泥截留在反应器内,没有污泥流失,从而使反应器内微生物数量不断增多,特别适用于AOB和Anammox菌的生长繁殖.这一点是其他反应器不具备的,也是最关键的一点.

图3 阶段Ⅱ反应器运行性能Fig.3 Performance of the reactor during stage Ⅱ

2.3 CANON工艺负荷提高

阶段Ⅲ为CANON工艺负荷提高阶段.阶段Ⅱ完成后,NH4+-N和NO2--N还有一定量的剩余,为进一步降低出水NH4+-N浓度,提高TNR,将曝气时间延长为10h.从图4可以看出,ARR和TNR迅速上升,直至第55d分别为99.78%和69.04%,这说明延长曝气时间,能够使更多的NH4+-N被氧化,同时Anammox菌活性也没有受到抑制.此时出水中NH4+-N浓度几乎为0,但还残留NO2--N,说明Anammox菌活性有待提高. Yang等[22]通过研究证明在厌氧氨氧化工艺中添加足够的无机碳浓度可以提高NRR.为此将碱度由1600提高到2000mg/L,并将曝气时间缩短至9h,减少AOB氧化NH4+-N的量,提高Anammox菌的活性.之后出水NH4+-N浓度虽有短暂升高但后来一直降低, 第59d再次降低到0左右并维持稳定.出水NO2--N呈下降趋势,最终接近0.第56至76d,ARR和TNR分别稳定在99%、84%左右, ΔNO3--N/ΔNH4+-N及ΔNO3--N/ΔTN分别稳定在0.12和0.14,接近于0.11和0.127[23].氮去除负荷最高可达0.41kg/(m3·d),平均氮去除负荷为0.38kg/(m3·d).表明MBR反应器内高效稳定的CANON工艺已经实现.

表4 CANON反应器启动时间总结Table 4 Summary of the start-up time for CANON reactors

图4 阶段Ⅲ反应器运行性能Fig.4 Performance of the reactor during stage Ⅲ

2.4 DGGE分析

图5 CANON工艺稳定期AOB和Anammox的DGGE图谱Fig.5 DGGE profiles of AOB and Anammox in stable phase of CANON process

由图5(a)可见,AOB有8个条带(1～8),说明反应器内AOB种类还是较多的.对这8条主要条带进行切割、溶解、回收、扩增,通过对DNA序列测序分析表明所有的AOB均属于βproteobacteria(表5),它们与Nitrosomonas的相似度都在97%及以上,表明Nitrosomonas是反应器内的优势菌种,且较稳定,这与Thomas F. Ducey等[24]的研究是一致的.并且Liu等[6]认为Nitrosomonas相对于Nitrosospira更适于在CANON反应器中生长,而Liu等[25]也发现Nitrosomonas是许多水生态系统中最常见的氨氧化菌类型.

图5(b)显示, Anammox有2个条带,均属于Planctomycetia(表5),其中条带9与Candidatus Kuenenia stuttgartiensis的相似度高达99%,条带10与anaerobic ammonium-oχidizing planctomycete的相似度也高达99%,这与Jing[26]等的研究结果是一致的.研究表明Candidatus Kuenenia stuttgartiensis是一种存在于淡水环境中的Anammox[27],而且在污水脱氮系统中常见[28]. DGGE图谱显示,本研究中Nitrosomonas和Candidatus Kuenenia stuttgartiensis 是CANON反应器内的优势菌种,共同完成脱氮过程.

表5 DGGE条带上AOB和Anammox的DNA序列比对结果Table 5 Results of sequence allignment between DNA sequences of AOB and Anammox from DGGE band

3 结论

3.1 首先,在限氧条件下启动亚硝化,控制DO为0.3mg/L,经过6d,NO2--N积累率达到50%左右,亚硝化启动成功.之后,降低DO至0.15～0.2mg/L,由亚硝化阶段向CANON工艺转变,经历36d实现了MBR内CANON工艺的快速启动.

3.2 通过调整曝气时间和添加无机碳源提高氮去除负荷,经过76d,氮去除负荷最高可达0.41kg/(m3·d),平均氮去除负荷为0.38kg/(m3·d).实现了MBR内CANON工艺的高效稳定运行.

3.3 DGGE图谱显示在CANON工艺稳定期, Nitrosomonas和Candidatus Kuenenia stuttgartiensis是反应器内的优势菌种,共同完成脱氮过程.

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The fast start-up of CANON process in MBR system and the characterization of microbes.

LI Dong1*, HE Yong-ping1, ZHANG Xiao-jing2, LIANG Yu-hai1, ZHANG Yu-long1, FAN Dan1(1.Key Laboratory of Beijing for Water Quality Science and Water Environment Recovery Engineering, Beijing University of Technology, Beijing 100124, China；2.State Key Laboratory of Urban Water Resource and Environment, Harbin Institute of Technology, Harbin 150090, China). China Environmental Science, 2014,34(11)：2788～2795

To investigate the fast start-up of CANON process and characterization of functional microbes, conventional activated sludge was inoculated to an MBR and the reactor was operated intermediately at ambient temperature. In the launch strategy, the regulation of aeration and aeration time was used as the main method. First, partial nitrification was applied under oxygen-limited condition. Secondly, DO had to be decreased further to achieve CANON process. Finally, aeration time and inorganic carbon concentration needed to be adjusted to improve the total nitrogen removal rate. Besides, the characterization of functional microbes in stable CANON process was analyzed using PCR-DGGE techniques. The results showed that the CANON process launched successfully after 36 days, the ammonium removal rate and total nitrogen removal rate were kept at around 99% and 84% and the maxinum nitrogen removal rate can reach 0.41kg/(m3·d). DGGE profiles showed Nitrosomonas and Candidatus Kuenenia stuttgartiensis were predominant microbes in the reactor and they worked synergetically to form an efficient autotrophic nitrogen removal process within the MBR.

MBR；conventional activated sludge；CANON；start-up；PCR-DGGE；microbes

X172

A

1000-6923(2014)11-2788-08

李 冬(1976-),女,辽宁丹东人,教授,博士,主要从事水质科学与水环境恢复关键技术研究.发表论文100余篇.

2014-01-22

国家自然科学基金(51222807);国家重大科技专项水专项(2012ZX07202-005)

* 责任作者, 教授, lidong2006@bjut.edu.cn