响应面法优化酿酒废酵母改性特性研究

陈卫林，阎晓菲，高 蕾，尹明远，王小标，苗 森，董新平，武 运*

（1.新疆农业大学 食品科学与药学学院，新疆 乌鲁木齐 830052；2.新疆农业大学 科学技术学院，新疆 乌鲁木齐 830052；3.新疆中信国安葡萄酒业有限公司，新疆 玛纳斯 832200）

随着工业的发展，重金属污染已经成为当今最重要的环境问题之一，生物吸附（biosorption）利用生物体或其衍生物吸附水中的金属离子，再经固液分离，可以达到水体净化目的，是一种可大量处理低浓度重金属废水的理想方法[1]。研究表明，许多藻类、细菌、真菌以及酵母等微生物都能有效地吸附水溶液中重金属离子[2-6]。我国是啤酒生产大国，废酵母的生成量非常可观，但我国对废酵母的利用还不是很充分，大多是经过简单加工制成粗蛋白饲料，甚至不加利用直接排入江河，造成了资源的极大浪费或环境污染[7-8]，将这些大量易于获取的廉价的生物材料制备成生物吸附剂，不仅可以减轻这些行业处理废弃菌体的负担，还可达到“以废治废”的目的[9]。另外，对吸附重金属后的酿酒废酵母进行洗脱，不但洗脱后的酵母可以对重金属进行再次吸附，洗脱液中的重金属也可以进行回收利用，变害为宝。

生物吸附主要是由于细胞壁上的官能团——蛋白质、肽、羧基、磺酸基等与金属离子的相互作用[10-11]，啤酒酵母细胞壁厚度为25～70nm，重量约占细胞干重的25%，主要成分为葡聚糖、甘露聚糖、蛋白质和几丁质，另有少量脂质[12-14]。为了提高其对重金属的吸附效率可对其进行简单的化学改性，常用的改性剂主要有酸、碱、盐等。一般而言，酸处理作用不明显，有时还会降低吸附性能，但刘恒等[15]发现酸处理过的啤酒酵母其吸附量增大；碱处理的主要作用是使吸附剂表面去质子化，减少重金属离子与氢根产生的斥力。张云松等[16]发现NaOH修饰菌表面的羧基、氨基、羟基、酰胺基和磷酰基等不同程度地参与了吸附反应，NaOH修饰菌具有较高的Cu2+吸附能力。

本实验以酿酒废酵母作为生物吸附剂，用HCl和NaOH作为改性剂探讨酿酒废酵母改性特性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酿酒废酵母：新疆乌苏啤酒厂。

硝酸铅（分析纯）：天津市福晨化学试剂厂；盐酸（分析纯）、氢氧化钠（分析纯）：天津市盛奥化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱：上海一恒科技仪器有限公司；MAS9000系列原子吸收光谱仪：北京盈安美诚科学仪器有限公司；THZ-82型气浴恒温振荡器：常州市国立试验设备研究所；TD5A-WS台式低速离心机：长沙湘仪离心机仪器有限公司；AR2130/C型电子精密天平：奥豪斯国际贸易（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酿酒废酵母改性工艺

酿酒废酵母菌体的制备：用蒸馏水将酿酒废酵母洗涤、离心数次，至上清液澄清，弃去上清液，收集菌体，在烘箱中80℃烘至质量恒定，冷却后粉碎成粉，过60目筛，干燥保存备用[17]。

改性酿酒废酵母菌体的制备：将获得的酿酒废酵母菌体用不同的改性剂，在不同的改性温度、液料比、改性时间以及改性剂浓度条件下对菌体进行改性，用蒸馏水将改性后的酵母洗涤、离心数次，至上清液呈中性，弃去上清液，收集菌体，在烘箱中80℃烘至质量恒定，冷却后粉碎成粉，过60目筛，干燥保存备用。

1.3.2 重金属溶液的配制

精密称取0.159 8g硝酸铅，用蒸馏水于100mL容量瓶中定容至刻度，制得1 000μg/mL的Pb2+溶液，将其作为母液。按试验需要的重金属浓度对母液进行稀释。

1.3.3 改性酿酒废酵母对Pb2+吸附率的测定方法

改性酿酒废酵母对Pb2+的吸附：移取20mL Pb2+（30μg/mL）溶液于三角瓶中，在水浴锅中预热至30℃，加入0.02g干燥改性酵母，于气浴恒温振荡器中30℃恒温振荡60min，取样过滤，用原子吸收光谱仪测定滤液中Pb2+浓度。Pb2+吸附率计算方法如下：

式中：ρ0为吸附前溶液中Pb2+浓度，mg/L；ρ1为吸附后溶液中Pb2+浓度，mg/L。

1.3.4 改性试验

改性剂的选择：将酿酒废酵母分别置于浓度为0.1mol/L、0.5mol/L、1.0mol/L的NaOH溶液和HCl溶液中，在改性温度30℃、改性时间60min、液料比为20∶1（mL∶g）条件下进行改性，用蒸馏水将改性后的酵母洗涤、离心数次，至上清液呈中性，弃去上清液，收集菌体，在烘箱中80℃烘至质量恒定，冷却后粉碎成粉，过60目筛，用改性后的酿酒废酵母粉吸附Pb2+并计算吸附率。

单因素试验：

（1）液料比对酿酒废酵母吸附Pb2+能力的影响：改性剂由改性剂的选择试验确定，浓度为0.3mol/L，液料比分别为10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1（mL∶g），其他条件同1.3.4 进行改性并计算其对Pb2+的吸附率。

（2）改性温度对酿酒废酵母吸附Pb2+能力的影响：料液比由（1）确定，改性温度分别为30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃其他条件同（1）进行改性并计算其对Pb2+的吸附率。

（3）改性时间对酿酒废酵母吸附Pb2+能力的影响：改性温度由（2）确定，改性时间分别为30min、90min、150min、210min、270min、330min，其他条件同（2）进行改性并计算其对Pb2+的吸附率。

（4）改性剂浓度对酿酒废酵母吸附Pb2+能力的影响：改性时间由（3）确定，改性剂浓度分别为0.1mol/L、0.3mol/L、0.5mol/L、0.8mol/L、1.1mol/L，其他条件同（3）进行改性并计算其对Pb2+的吸附率。

响应面优化试验：在单因素试验的基础上，综合考虑各单因素对酿酒废酵母对Pb2+吸附的影响，采用统计分析软件建立4因素3水平的Box-Behnken模型，确定最优改性工艺。以酿酒废酵母对Pb2+的吸附率为响应值，改性时间、改性温度、料液比及改性剂浓度为自变量，变量因素编码及水平见表1。

表1 Box-Behnken设计因素水平及编码Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果与分析

2.1.1 改性剂的选择

表2 不同改性剂对吸附率的影响Table 2 Effect of different modifier on adsorption rate

由表2可知用NaOH改性可以提高酿酒废酵母对Pb2+的吸附率，用HCl改性可以降低酿酒废酵母对Pb2+的吸附率，因此选择NaOH作为最优改性剂。用NaOH改性可以提高酿酒废酵母对Pb2+的吸附率可能是由于酵母细胞壁中的酰胺键及酯键在碱性条件下水解出氨基、羟基和羧基等，从而提高了其吸附能力[18]。

2.1.2 液料比对酿酒废酵母吸附Pb2+能力的影响

图1 液料比对吸附率的影响Fig.1 Effect of liquid-solid ratio on adsorption rate

由图1可知，酿酒废酵母对Pb2+的吸附率随着液料比的增加而逐渐提高，当液料比为40∶1（mL∶g）时吸附率达到最大值，此后随着液料比的增加酿酒废酵母对Pb2+的吸附率反而降低。这可能是由于吸附率在未达到最大值之前，改性剂的相对量不够，酿酒废酵母表面吸附位点没有完全暴露，随着液料比的增加而逐渐暴露，吸附率也随之提高，吸附率达到最大值之后，随着液料比的增加，改性剂的量相对过剩，反而破坏了能够与Pb2+结合的官能团，从而降低了吸附率。因此确定最佳液料比为40∶1（mL∶g）。

2.1.3 改性温度对酿酒废酵母吸附Pb2+能力的影响

图2 改性温度对吸附率的影响Fig.2 Effect of modification temperature on adsorption rate

由图2可知，酿酒废酵母对Pb2+的吸附率随着改性温度的增高而逐渐提高，当改性温度为40℃时吸附率达到最大值，此后随着改性温度的升高酿酒废酵母对Pb2+的吸附率反而降低。这可能是由于过高的温度破坏了能够与Pb2+结合的官能团，从而降低了吸附率。因此确定最佳改性温度为40℃。

2.1.4 改性时间对酿酒废酵母吸附Pb2+能力的影响

由图3可知，改性时间在30～150min期间酿酒废酵母对Pb2+的吸附率变化不大，在150～270min期间吸附率随着改性时间的延长而逐渐提高，当改性时间为270min时吸附率达到最大值，此后随着改性时间的延长酿酒废酵母对Pb2+的吸附率降低。这可能是由于改性时间过长，能够与Pb2+结合的官能团被破坏而造成的。因此确定最佳改性时间为270min。

图3 改性时间对吸附率的影响Fig.3 Effect of modification time on adsorption rate

2.1.5 改性剂浓度对酿酒废酵母吸附Pb2+能力的影响

图4 改性剂浓度对吸附率的影响Fig.4 Effect of modifier concentration on adsorption rate

由图4可知，酿酒废酵母对Pb2+的吸附率随着改性剂浓度的增大而逐渐提高，当改性剂浓度为0.3mol/L时吸附率达到最大值，此后随着改性剂浓度的增大酿酒废酵母对Pb2+的吸附率降低。这可能是由于过高的改性剂浓度破坏了能够与Pb2+结合的官能团，从而降低了吸附率。因此确定最佳改性剂浓度为0.3mol/L。

2.2 响应面法优化酿酒废酵母改性条件

2.2.1 Box-Benhnken 的中心组合设计试验

对酿酒废酵母改性工艺进行响应面分析，具体试验方案及结果见表3。

利用Design Expert软件对各因素进行二次多元回归拟合，得到二次多项回归方程：

表4为回归模型方差分析结果，回归方差分析显著性检验表明该回归模型极显著（P=0.000 8＜0.01），失拟项不显著（P=0.104 7＞0.05），并且该模型R2=0.862 1，R2adj=0.724 2，模型信噪比（adeq precision=8.961）大于临界值4，说明该模型与试验拟合情况良好，可以用该回归方程代替试验真实点对试验结果进行分析和预测。

表3 响应面试验方案与试验结果Table 3 Experimental design and result of response surface methodology

由表4方差分析结果可知，对方程影响程度由大到小依次为改性温度、液料比、改性剂浓度和改性时间，改性温度对方程影响最显著，说明改性温度直接关系酿酒废酵母对Pb2+吸附率的大小，而液料比、改性剂浓度和改性时间对酿酒废酵母吸附Pb2+的吸附率影响不显著。A、A2对模型的影响极显著（P＜0.001），B2和C2项对模型的影响高度显著（P＜0.01）；交互项BC对模型的影响也达到了显著水平（P＜0.05），表明各因素之间不是简单的线性关系，而是二次关系。

表4 回归模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

2.2.2 响应面结果分析

由图5的响应曲面可以看出，在所选参数范围内存在响应面最高点及极值，说明参数所选范围合理；吸附率随着改性温度的变化其变化率最大，液料比次之，改性剂浓度和改性时间不明显，说明改性温度对吸附率的改变贡献最大，直接关系酿酒废酵母对Pb2+吸附率的大小。

2.2.3 响应面结果验证试验

由模型方程计算可得，最优改性方案为改性温度43.09℃，液料比40.62∶1（mL∶g），改性时间270.02min，改性剂浓度0.32mol/L，理论最大吸附率为90.24%。根据操作的可行性将以上条件调整为改性温度43℃，液料比41∶1（mL∶g），改性时间270min，改性剂浓度0.32mol/L，重复3次试验，平均Pb2+吸附率为89.96%，与预测值基本一致。

3 结论

为提高酿酒废酵母对重金属的吸附能力，对酿酒废酵母进行改性，通过改性剂的选择试验发现，用NaOH作为改性剂可以提高酿酒废酵母对Pb2+的吸附率，HCl反而降低酿酒废酵母对Pb2+的吸附率，因此选择NaOH作为最优改性剂。

以NaOH作为最优改性剂，通过单因素试验和响应面试验对酿酒废酵母改性工艺条件进行优化，研究结果表明改性温度对改性效果影响最大，并且料液比与改性时间存在交互作用。得到二次多项式回归模型为：吸附率=89.49+4.51A+1.18B-0.14C+0.19D-2.12AB-0.46AC+0.93AD+3.72BC+60.27BD+0.6CD-7.23A2-4.49B2-4.77C2-2.4D2。最佳改性条件为改性温度43℃，液料比41∶1(mL∶g)，改性时间270min，改性剂浓度0.32mol/L。经过验证试验可知在此条件下制得的改性酿酒废酵母对Pb2+的吸附率可达89.96%，与预测值基本一致，可为以后的酵母改性提供理论指导。

图5 各因素相互作用对吸附率影响的响应曲面及等高线图Fig.5 Response surface plot and contour line of interaction among each factors on adsorption rate

[1]陈 灿，王建龙.酿酒酵母吸附重金属离子的研究进展[J].中国生物工程杂志，2006，26（1）：69-76.

[2]江用彬，季宏兵.藻类对重金属污染水体的生物修复[J].地理科学进展，2007，26（1）：56-67.

[3]李兰松，杨永珍，贾虎生，等.铜抗性菌株的筛选及其对Cu2+吸附性能[J].化工学报，2013，64（9）：3381-3389.

[4]许爱清，向言词，李会东.运用丝状真菌生物质生物吸附镉（Ⅱ）污染物的研究[J].环境科学与技术，2013，36（4）：55-61.

[5]葛 凤，武 运，聂 威，等.固定化酿酒废酵母吸附Pb2+的动力学及等温吸附研[J].食品与机械，2012，28（1）：29-31.

[6]李志东，李 娜，张洪林，等.啤酒酵母吸附重金属离子铬的研究[J].中国酿造，2006，25（10）：38-41.

[7]代淑娟，魏德洲，周冬琴，等.水洗预处理对啤酒废酵母吸附电镀废水中镉的影响[J].有色金属，2008，60（1）：120-124.

[8]孙伟峰，周素梅，王 强.废啤酒酵母综合利用研究进展[J].化工进展，2008，27（7）：990-1000.

[9]FOUREST E,VOLESKY B.Contribution of sulfonate groups and alginate to heavy metal biosorption by the dry biomass ofSargassum fluitans[J].Environ Sci Technol,1996,30(1):227-282.

[10]DRAKE L R,LIN S,RAYSON G D.Chemical modification and metal binding studies of daturainnoxia[J].Environ Sci Technol,1996,30(1):110-114.

[11]陈 灿，王建龙.生物吸附法去除重金属离子的研究进展[J].环境科学学报，2010，30（4）：673-701.

[13]OFER R,YERACHMIEL A,SHMUEL Y.Mechanisms of biosorption of different heavy metals by brown marine macroalgae[J].Biotechnol Bioeng,2004,87(4):451-458.

[14]ANITA I,KALPANA M,BHAVANATH J.Biosorption of heavy metals by a marine bacterium[J].Mar Pollut Bull,2005,50(3):340-343.

[15]刘 恒，王建龙，文湘华.啤酒酵母吸附重金属离子铅的研究[J].环境科学研究，2002，15（2）：26-29.

[16]张云松，王仁国，代先祥，等.修饰作用对面包酵母细胞形貌及其吸附Cu2+性能的影响比较[J].环境科学学报，2008，28（5）：897-901.

[17]徐惠娟，廖生赟，龙敏南，等.啤酒酵母生物吸附镉的研究[J].工业微生物，2004，34（2）：10-14.

[18]陈慧娟，张敬华，韩润平.不同化学修饰后酵母菌吸附铜离子研究[J].信阳农业高等专科学校学报，2007，2（17）：124-125.