北京地区四个规模化猪场的猪链球菌病流行病学调查

刘修权 贾泽颖 孙玉芳 刘邓 郭又春 全炎铭 刘莉如

（北京三元集团畜牧兽医总站，北京 100192）

北京地区四个规模化猪场的猪链球菌病流行病学调查

刘修权 贾泽颖 孙玉芳 刘邓 郭又春 全炎铭 刘莉如

（北京三元集团畜牧兽医总站，北京 100192）

本试验从北京地区四个规模化猪场的74头疑似猪链球菌病的仔猪组织中分离培养获得56株猪源链球菌，并进行了API 20 Strep生化鉴定、16S rRNA基因序列比对和药敏试验。试验结果表明：56株猪源链球菌分别属于粪肠球菌、屎肠球菌、鸟链球菌、马链球菌兽疫亚种、豕链球菌和猪链球菌，其中以兰氏D群粪肠球菌为主（23/56，41.07%），其次为兰氏C群马链球菌兽疫亚种（14/56，25.00%）；对10种临床常用抗生素均产生了耐药性，耐药比例从12.50%至92.86%不等，对红霉素的耐药比例最高（52/56，92.86%），对新霉素的耐药比例最低（7/56，12.50%），且多重耐药性现象极为严峻。

猪链球菌病；血清分群；药敏试验

猪链球菌病（Swine Streptococosis）是由链球菌感染引起的猪的一类疫病的总称，其病原主要包括马链球菌兽疫亚种（Streptococcus cqui subsp zooepodemicus），兰氏分群中的D、E、L群链球菌以及猪链球菌（Strptococcussuis）[1]。该病分布广泛，世界各地均有不同程度的流行[2]。我国猪链球菌病较大范围的流行始于1963年广西省部分地区，而其在20世纪70年代至80年代之间日趋严重，许多地方呈暴发流行或地方性流行[3]。后随着疫苗的研制和推广，马链球菌兽疫亚种所致猪链球菌病的蔓延得到了一定程度的遏制。然而20世纪90年代初，广东首次报道了2型猪链球菌致病[4]，此后多地又陆续报道了该型猪链球菌病的发生[5]。

目前，疫苗免疫和抗生素治疗是防控该病的主要措施。但由于致病性链球菌血清型繁多，各血清型菌株之间缺乏有效的交叉免疫保护[6]，且链球菌易产生耐药性，给疫病的防治带来了困难。本研究对北京地区四个规模化猪场疑似猪链球菌病的仔猪病例进行了组织分离培养，并在此基础上系统开展了链球菌兰氏血清分群、API 20 Strep生化鉴定、16S rRNA基因序列比对和药敏试验等工作，以期探明本病在该地区的流行规律，为针对性地选用疫苗和抗生素防控该病提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

标准菌株引自中国兽医药品监察所；API Strep 20生化鉴定试剂条购自法国生物梅里埃公司；7%绵羊血琼脂培养基购自安图绿科生物工程有限公司；其他培养基干粉购自英国OXID公司，按说明书自行配制；细菌基因组DNA提取试剂盒、Taq DNA聚合酶、Taq PCR Master Mix均购自天根生化科技（北京）有限公司；PCR引物由深圳华大基因科技服务有限公司合成；药敏纸片购自北京陆桥技术有限责任公司。

1.2 方法

1.2.1 细菌的分离培养

根据临床症状挑选疑似猪链球菌病的仔猪病例，剖检后采集脾脏、淋巴结和关节液等病料，无菌接种于7%绵羊血琼脂平板，37℃恒温培养18～24小时，观察菌落形态。挑取可疑菌落纯化培养后保存，以供后续试验用。

1.2.2 生化鉴定

将纯化培养后的可疑菌株接种于胰蛋白胨大豆琼脂表面培养基（TSA），37℃恒温培养箱过夜培养，以玻片法进行触酶试验。触酶试验阳性者，取新鲜纯培养物用API 20 Strep生化鉴定试剂条进行生化鉴定，操作方法和判定标准见说明书。

1.2.3 16S rRNA PCR检测

按细菌基因组DNA提取试剂盒操作说明，提取细菌基因组DNA。参照参考文献[7]设计、合成、扩增完整16S rRNA基因的PCR引物，上游引物序列为5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′，下游引物序列为5′-TACGGYTACCTT GTTACGACTT-3′。

PCR反应体系为：2×Easy Taq PCR Super Mix 25μL，Primer 5和Primer 6（10μmol/L）各1μL，dd H2O 2μL，DNA模板1μL；反应条件为：94℃预变性4分钟，94℃变性30秒，65℃退火40秒，72℃延伸90秒，扩增35个循环，然后72℃延伸10分钟，4℃保存。扩增产物用1.2%琼脂糖凝胶进行电泳分析，并送至深圳华大基因科技服务有限公司进行测序拼接。将测得序列通过NCBI的Blast检索系统（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast/）进行同源性分析。

1.2.4 药敏试验

根据美国临床和实验室标准协会（NCCLS）的操作和判定标准[8]，采用药敏纸片扩散法（K-B法）对分离到的各菌株进行药敏试验。药敏纸片种类包括：青霉素（P）、氨苄西林（AM）、链霉素（S）、庆大霉素（GM）、氯霉素（C）、红霉素（E）、新霉素（N）、四环素（TE）、诺氟沙星（NOR）及环丙沙星（CIP）。

2 结果与分析

2.1 发病情况

从北京地区四个规模化猪场收集临床疑似猪链球菌病的病例共计74例。所有病例均为保育阶段以下的猪只，其中慢性型病例占47.30%（35/74），急性败血型（败血症）病例占18.92%（14/74），脑膜炎型（神经症状）病例占9.46%（7/74），混合症状的病例占24.32%（18/74）。

2.2 细菌分离和生化鉴定

本试验共分离到链球菌56株，检出率为75.68%（56/74）。革兰氏染色镜检均为阳性球菌，液体病料涂片和固体培养物经革兰氏染色镜检，可见菌体多为散在状态，液体过夜培养物多以长链状态存在。在去纤维绵羊血琼脂平板培养时，菌落溶血状态不一，表现为α溶血、β溶血或不溶血。触酶试验均为阴性，API 20 Strep生化条鉴定后，判定上述菌株均为链球菌属，结果如表1所示：粪肠球菌23株，占41.07%；屎肠球菌8株，占14.29%；马链球菌兽疫亚种14株，占25.00%；坚忍链球菌1株，占1.79%；鸟链球菌2株，占3.57%；1型猪链球菌2株，占3.57%；2型猪链球菌1株，占1.79%；豕链球菌1株，占1.79%；未能鉴定出的菌株4株，占7.14%。各分离株的生化反应差异较大，且鉴定为同一菌名的细菌之间生化反应也存在一定程度的差异。

表1 链球菌分离株统计表

2.3 16S rRNA PCR产物序列比对

对56株细菌的16S rRNA基因进行PCR和琼脂糖凝胶电泳后，均在1 500 bp处出现特异性电泳条带。对各扩增子进行测序后，得到序列峰图，各引物的下游800 bp以内均无套峰或重峰等现象，且信号强度良好，说明测序结果完全满足后续序列拼接要求。

将各菌株的上游引物测得序列反向互补后，用LaserGene软件包中的MegAlign子软件与对应下游引物测得序列进行比对，得到1 500 bp左右的拼接序列。进一步将拼接后的序列通过NCBI的Blast检索系统与基因库中所有序列进行同源性比对，同源性高于95%者表明与基因库中登记菌株属于相同细菌。结果如表1所示：粪肠球菌23株；屎肠球菌9株；马链球菌兽疫亚种14株；鸟链球菌2株；1型猪链球菌2株；2型猪链球菌1株；7型猪链球菌1株；9型猪链球菌3株；豕链球菌1株。

2.4 药敏试验

由表2可知，56株分离株已对临床上常用的多种抗生素产生了耐药性，耐药比例从12.50%至92.86%不等。对红霉素的耐药比例高达92.86%，其次为青霉素、链霉素、氯霉素、环丙沙星、庆大霉素、氨苄西林、诺氟沙星、四环素和新霉素，耐药比例分别为87.50%、82.14%、73.21%、57.14%、42.86%、28.57%、26.79%、16.07%及12.50%。

表2 K-B法药敏试验结果

3 讨论

猪链球菌病分布广泛，世界各地均有不同程度的流行。在我国，该病对饲养密度较大的规模化猪场危害日益严重，制约着养猪业的发展。疫苗免疫和抗生素治疗是防控该病的主要措施。然而，由于致病性链球菌血清型繁多且缺乏有效的交叉免疫保护，再加上细菌耐药现象日益严峻，给该病的防治带来了困难[9]。北京地区许多规模化猪场时有猪链球菌病的发生，为有效防控该病的流行，有必要对该病进行流行病学调查。

本研究从北京地区四个规模化猪场筛选了74头疑似猪链球菌病的仔猪病例，通过组织分离培养获得56株猪源链球菌，并进行了生化鉴定和16S rRNA基因序列比对。所有74头病例均为保育阶段以下的猪只，其中慢性型病例有35头，占比最高，达47.30%。慢性型的病例临床上主要表现为关节炎、心内膜炎、化脓性淋巴结炎、皮炎等症状，病程多达十几天至一个多月，症状较缓和。综合生化鉴定和16S rRNA测序比对结果，确定北京地区猪链球菌病的病原主要为兰氏D群链球菌（粪肠球菌、屎肠球菌、坚忍链球菌和鸟链球菌），占60.71%（34/56），其次为兰氏C群，占25.00%（14/56），这与国内的一些报道结果一致[10]。值得注意的是，本研究中采用API 20 Strep生化鉴定和16S rRNA测序进行结果比对，符合率为91.07%，差异主要表现在5株细菌（表1）。其中，1株细菌API 20 Strep生化鉴定结果为坚忍链球菌，而16S rRNA测序结果鉴定为屎肠球菌；4株细菌API 20 Strep未能鉴定出，而16S rRNA测序结果分别为7型和9型猪链球菌。由于链球菌血清型众多，不同链球菌菌株之间存在表型差异，表现为生化反应谱之间的差异，而16S rRNA基因的核苷酸序列在同种或同型链球菌之间高度保守。本试验结果表明，16S rRNA基因序列测定可以用于猪链球菌病病原菌的鉴定。

本研究药敏试验结果表明，分离到的链球菌对临床上常用的10种抗生素均产生了不同程度的耐药性，对红霉素的耐药比例高达92.86%，对新霉素的耐药比例最低，但也达到了12.50%。值得注意的是，56株细菌的多重耐药现象极为严峻和复杂，共有56种耐药谱。其中，二重和三重耐药谱各有2种耐药谱，菌株数各为2株，分别占3.57%；四重耐药有14种耐药谱，菌株数为19株，占33.93%；五重耐药有12种耐药谱，菌株数为15株，占26.79%；六重耐药有5种耐药谱，菌株数为12株，占21.43%；七重耐药有4种耐药谱，菌株数为4株，占7.14%；八重和九重耐药各有1种耐药谱，菌株数各为1株，各占1.79%。这提示我们应合理使用抗生素，严控抗生素的滥用。因此，建议有条件的养殖场在治疗前先进行药敏试验以选用敏感的抗生素。

综上所述，猪链球菌病对北京地区规模化猪场威胁严重，其病原以兰氏D群链球菌为主，且菌株耐药性问题突出。目前，商品化猪链球菌疫苗以C群和2型猪链球菌二价联苗为主，对该病的防控效果有限。因此，如何有效防控猪链球菌病的问题亟待深入研究。

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S851.38

B

1673-4645（2014）07-0033-04

2014-06-26

北京三元种业科技股份有限公司自立科研课题-猪链球菌病病原菌的分离鉴定及其防治研究

刘修权（1985-），男，硕士，主要从事畜禽疫病检测工作