大孔吸附树脂纯化铁苋菜总黄酮的工艺研究

杨艳俊，吉惠杰，李成成

（吉林化工学院 化学与制药工程学院，吉林 吉林 132022）

0 引言

铁苋菜（A.australis）是大戟科铁苋菜属的一年生草本植物.铁苋菜生于旷野、路边等较湿润的地方，广泛分布于黄河流域中下游及长江以南各地[1]，又名人苋、血见愁、海蚌含珠、撮斗装珍珠、叶里含珠、野麻草等[2]，为大戟科植物铁苋菜全草，味苦涩性平[3]，具有清热解毒、消积、止痢和止血的功效，可用于治疗痢疾、吐血、便血、崩漏、创伤出血等[4].铁觅菜可以显著改善腹泻、便血、体质量减轻、结肠肠膜溃疡糜烂、充血水肿等症状，对于溃疡性结肠炎具有疗效[5]，不同的提取液的抗菌效果也不尽相同[6-7]，并且具有抗氧化作用[8].铁苋菜有明显的袪痰止咳作用[9]，并且具有促进心肌组织的正常化的功能[10].铁苋菜的化学成分包括黄酮类化合物[11-12]、没食子酸[13]、谷甾醇等甾醇类化合物[14]和多种挥发性成分[15].其中黄酮类化合物有芦丁[4]、白杨素、高良姜黄素、山萘酚苷[16]，黄酮类化合物具有多种生物活性，如抗氧化、抗炎、抗微生物、抗肿瘤等作用[17].

近年来，大孔吸附树脂被广泛应用于医药、环保和食品等领域，在中草药研究方面也被广泛应用.本试验通过几种不同极性的大孔吸附树脂纯化铁苋菜总黄酮，筛选适合应用的树脂，并且对纯化工艺进行研究.铁苋菜这一宝贵资源的高效利用，对促进优势资源转化有着重要的意义.

1 材料与方法

1.1 材料

铁苋菜购于河北安国市冷背药材有限公司；芦丁为自制，含量≥96%；无水乙醇、盐酸、氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝等均为分析纯；AB-8、HPD-100、D-101、DM-301、DM130 由天津市海光化工有限公司生产.

1.2 仪器与设备

RT-08 粉碎机：荣聪精密科技有限公司；KQ-250B 超声仪：昆山市超声仪器有限公司；TU-1810紫外可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司.

1.3 试验方法

1.3.1 对照品溶液的配制

精确称取干燥至恒质量的芦丁10 mg，加入60%的乙醇适量，超声处理使之溶解，用60%的乙醇定容至100 mL，配制成浓度为0.1 mg/mL 的芦丁溶液，备用.

1.3.2 供试品溶液的制备

将铁苋菜用粉碎机粉碎，过40 目筛，取50 g，分别加入15 倍生药量的80%乙醇，85 ℃加热微沸回流提取2 次，时间为每次5 h，合并提取液，过滤，旋转蒸发至无醇味，即得铁苋菜提取液，备用.

1.3.3 供试品最大吸收波长的测定

取上述供试品溶液1 mL 于25 mL 容量瓶中，加入5%的NaNO2溶液0.8 mL，摇匀，放置6 min，加入10% 的Al（NO3）3溶液0.8 mL，放置6 min 后再加入1 mol/L 的NaOH 溶液10 mL，摇匀显色，定容，用紫外可见分光光度计测得最大吸收波长为500 nm.

1.3.4 线性关系考察

精确称取0.1 mg/mL 芦丁标准溶液0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 mL 分置于25 mL 容量瓶中，加入上述显色剂显色，定容，以零管为空白.在500 nm 处测定吸光度.以芦丁浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线.求得标准曲线方程为：y=10.832C-0.001 5（C 的单位为mg/mL），R2=0.999 7，芦丁质量浓度在0.000 8～0.004 8 mg/mL范围内与吸光度呈良好的线性关系.

1.3.5 精密度试验

取上述8.0 mL 标准品溶液，依照紫外分光光度法在500 nm 处连续测定6 次，求得吸光度平均值为0.318，RSD 为0.345 1%，结果表明精密度较好.

2 结果与分析

2.1 树脂吸附与解吸能力考察

2.1.1 树脂静态吸附与解吸考察

取处理后的树脂AB-8、D-101、HPD-100、DM301、DM130 各4 g，加入到100 mL 锥形瓶中，加入40 mL 总黄酮质量浓度为1.344 5 mg/mL 的提取液，每5 min 振摇一次，每次10 s，共2 h，静置48 h，过滤.取树脂吸附后的药液2 mL 于25 mL 容量瓶中，加入显色剂，在500 nm 处测定吸光度A，计算吸附率.将静态吸附的树脂抽滤至干，室温条件下，加入100 mL 75%乙醇解吸，每5 min振摇1 次，每次10 s，共2 h，静置48 h，过滤.分别取解吸后的药液4 mL 于25 mL 容量瓶中，加入显色剂，在500 nm 处测定吸光度A，计算解吸率.结果见表1.

表1 铁苋菜总黄酮的静态吸附率与解吸率

从表1 可以看出，5 种树脂的静态吸附率较高的是D-101、HPD-100、DM301，其中解吸率较高的是D-101.考察这3 种树脂的动态吸附与解吸效果，选出最适合的树脂.

2.1.2 树脂动态吸附与解吸考察

取处理后的树脂D-101、HPD-100、DM301，各15 g，湿法加入到树脂柱中，分别加入150 mL 总黄酮质量浓度为1.217 5 mg/mL 的提取液，以2 BV/h的流速进行动态吸附，收集吸附后的溶液3 mL 于25 mL 容量瓶中，加入显色剂，定容，在500 nm 处测吸光度.再用250 mL 75%乙醇以2 BV/h 的流速进行解吸，分别收集解吸液4 mL 于25 mL 容量瓶中，加入显色剂，定容，在500 nm 处测定吸光度.3 种树脂在相同条件下的动态吸附与解吸效果，见表2.

表2 铁苋菜总黄酮的动态吸附率与解析率

由表2 可以看出，DM301 的吸附与解吸效果较D-101 好，DM301 的吸附率虽然比HPD-100 的低，但解吸率比HPD-100 的高，以黄酮的解析量来看DM301 最高，故选择DM301 进行树脂进一步工艺优化研究.

2.2 DM301 型大孔吸附树脂工艺优化研究

2.2.1 上样液质量浓度的考察

取DM301 大孔吸附树脂5 份，各6 g，湿法装柱，分别加入铁苋菜总黄酮提取液（总黄酮质量浓度为2.924 mg/mL）以及稀释0、2、4、8、16 倍的样品溶液（体积分别为22.5、45、90、180、360 mL），先以2 BV/h 的流速进行吸附，分别收集过柱液并记录体积，然后以75%乙醇各50 mL 以2 BV/h 的流速进行解吸，分别收集洗脱液并记录体积，在500 nm 处测定吸光度，计算吸附率与解吸率.

表3 上样液质量浓度考察结果

由表3 可知，随着上柱药液质量浓度的降低，吸附率逐渐下降，而解吸率逐渐升高，但随着解吸率的升高，解吸量下降.综合考虑，选择质量浓度为1.462 mg/mL.

2.2.2 动态吸附曲线的考察

取DM301 树脂6 g（9 mL），湿法加入到树脂柱中，加入适量总黄酮质量浓度为1.462 mg/mL 的铁苋菜提取液，以1 BV/h 的流速进行动态吸附，收集流出液，开始时每1 BV（9 mL）为一个流份，共5 个，以后每5 mL 为一个流份，选择不同流份依次显色，于500 nm 处测定总黄酮含量，以流出液体积为横坐标，流出液中总黄酮质量浓度为纵坐标，作动态吸附曲线，计算树脂吸附量，结果见图1.

由图1 可以看出，当到第5 个点时，吸附余液的浓度大于原液浓度的1/10，此时达到了目标物的泄露点，树脂吸附黄酮量为65.79 mg.

图1 动态吸附曲线

2.2.3 吸附速率的考察

取DM301 大孔吸附树脂，湿法装柱，加入铁苋菜总黄酮提取液（总黄酮质量浓度为1.462 mg/mL）45 mL，分别以1、2、3、4、5 BV/h 的流速进行吸附，分别收集过柱液并记录体积，取各树脂吸附后的药液于500 nm 处测定吸光度，计算吸附率.然后以75%乙醇各30 mL 以2 BV/h 的流速进行解吸，分别收集洗脱液并记录体积，于500 nm 处测定吸光度，计算解吸率，结果见表4.

由表4 可以看出，吸附速率的大小对吸附率没有太大影响，但解吸率随着吸附速率的加快而降低，2 BV/h 时解吸率最大，其原因可能是吸附速率的快慢对树脂吸附是否均匀有影响，吸附速率较快，树脂吸附较均匀，解吸率较低，综合考虑吸附速率选2 BV/h 为宜.

表4 吸附速率考察结果

2.2.4 解吸液质量浓度的考察

取DM301 大孔吸附树脂，湿法装柱，分别加入铁苋菜总黄酮提取液（总黄酮质量浓度为1.416 mg/mL）45 mL，以2 BV/h 的流速进行吸附后，收集过柱液并记录体积，分别以30%、50%、75%、95%乙醇各30 mL 以2 BV/h 的流速进行解吸，分别收集洗脱液并记录体积，于500 nm 处测定吸光度，计算解吸率，结果见表5.

由表5 可以看出，在其他纯化条件相同时，随着解吸液乙醇浓度的增大，解吸率先增大后减小，所以最佳解吸液乙醇浓度为75%.

表5 解吸液乙醇浓度考察结果

2.2.5 解吸速率考察

取DM301 大孔吸附树脂5 份，各6 g，湿法装柱，分别加入铁苋菜总黄酮提取液（总黄酮质量浓度为1.395 mg/mL）45 mL，以2 BV/h 的流速进行吸附后，分别收集过柱液并记录体积，分别以75%乙醇各30 mL 以1、2、3、4、5 BV/h 的流速进行解吸，分别收集洗脱液并记录体积，于500 nm 处测定吸光度，计算解吸率，见表6.

表6 解吸速率考察结果

2.2.6 洗脱终点考察

取DM301 大孔吸附树脂1 份6 g，湿法装柱，分别加入铁苋菜总黄酮提取液（总黄酮质量浓度为1.489 mg/mL）45 mL，以2 BV/h 的流速进行吸附后，收集过柱液并记录体积，以75%乙醇适量以2 BV/h 的流速进行解吸，分别收集1/3 BV 的洗脱液，于500 nm 处测定吸光度，计算总黄酮含量，结果见图2.

由图2 可以看出，当洗脱液用量到第10 个点时（10/3 BV），洗脱液中总黄酮的质量浓度已经较低，当洗脱液用量到第12 个点时（4 BV）时，已经基本将总黄酮洗脱完全，为避免造成资源浪费，选择洗脱液用量为10/3 BV（30 mL）.

图2 洗脱终点曲线

2.2.7 上柱液pH 考察

取DM301 大孔吸附树脂7 份，各6 g，湿法装柱，分别加入铁苋菜提取液（总黄酮质量浓度为1.489 mg/mL）45 mL，分别将pH 调为1、2、3、4、5、7、9 的溶液加入柱内，以2 BV/h 的流速进行吸附，收集过柱液，于500 nm 处测定吸光度，计算吸附率.然后以75%乙醇各30 mL 以2 BV/h 的流速进行解吸，收集洗脱液，于500 nm 处测定吸光度，计算解吸率.结果见表7.

表7 上柱液体pH 的考察结果

由表7 可以看出，在其他纯化条件相同时，随着上柱液体pH 值的增大，吸附率先增大后减小，吸附率与解吸率有明显的变化趋势，综合考虑吸附率与解吸率，上柱药液pH 值选择为4.

2.3 验证试验

为了考察上述优化工艺的稳定性，采用最佳工艺条件，进行3 次验证性试验，计算干浸膏中总黄酮的纯度，结果见表8.

表8 工艺验证试验考察结果

由表8 可以看出，经DM301 大孔吸附树脂处理的铁苋菜提取液，干浸膏中总黄酮纯度由7.4%提高到平均30.9%，且具有较好的重现性.

3 结论

对5 种不同型号的大孔吸附树脂进行了铁苋菜总黄酮纯化试验，5 种树脂均为非极性或弱极性的树脂，适于对黄酮类化合物进行纯化，从吸附量确定了DM301 型大孔吸附树脂分离纯化铁苋菜总黄酮的效果比较理想.其最佳工艺为：上柱药液质量浓度为1.462 mg/mL，药液pH 值为4，吸附速率为2 BV/h，再用10/3 BV 的75%乙醇以2 BV/h 的流速洗脱，解吸率平均可达到90%，干浸膏中总黄酮的含量由原来的7.4%提高到30.9%，树脂富集倍数约为4.5 倍，表明DM301 型大孔吸附树脂对铁苋菜总黄酮具有一定的纯化性能，为铁苋菜总黄酮的工业化生产提供了理论依据.

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