谷胱甘肽S-转移酶基因遗传多态性与特发性男性不育症相关性研究*

唐开发徐绍源邹铁军丁上书刘睿智王新阳田 源孙 发**邢俊平**

1. 贵阳医学院附属医院泌尿外科（贵阳 550004）;

2. 西安交通大学医学院第一附属医院泌尿外科; 3. 陕西省人民医院泌尿外科

·论 著·

谷胱甘肽S-转移酶基因遗传多态性与特发性男性不育症相关性研究*

唐开发1徐绍源2邹铁军3丁上书2刘睿智2王新阳2田 源1孙 发1**邢俊平2**

1. 贵阳医学院附属医院泌尿外科（贵阳 550004）;

2. 西安交通大学医学院第一附属医院泌尿外科; 3. 陕西省人民医院泌尿外科

目的该研究旨在探讨谷胱甘肽S-转移酶基因（GST）M1、T1及P1基因多态性与特发性男性不育症的相关性。方法该病例-对照研究包括246例特发性少弱精子症男性不育患者及117例正常健康有生育史男性对照。采用聚合酶链反应（PCR）、聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）方法分别对GSTM1、GSTT1和GSTP1基因进行分型。结果GSTM1基因缺失型在正常对照组和特发性少弱精子症不育患者组基因型频率分别为41.88%和60.57%，具有显著差异（P=0.001）；GST T1基因缺失型在正常对照组和特发性少弱精子症不育患者组基因型频率分别为47.86%和62.60%，具有显著差异（P=0.008）；GSTM1/T1基因缺失型在正常对照组和特发性少弱精子症不育患者组基因型频率分别为14.53%和38.62%，具有显著差异（P＜0.001）；GSTP1基因突变型在正常对照组和特发性少弱精子症不育患者组基因型频率分别为27.35%和32.11%，无明显差异（P=0.847）。结论GSTM1、GSTT1基因缺失型分别是特发性男性不育症的危险因素。GSTP1基因突变型与特发性男性不育症患者无明显相关性。

男性不育症; 谷胱甘肽S-转移酶; 多态性

男性不育症（Male infertility）是指夫妇同居一年以上，未采取任何避孕措施，由于男性方面的原因导致女方不能受孕者[1]。其中有30%的男性不育症患者未发现明确的致病原因，包括发病机制及病理生理过程均不清楚，故称之为特发性男性不育症（Idiopathic oligoasthezoonspermia）[2]，男性不育症是多因素相互作用而引起的疾病，其发病机制包括遗传因素和环境因素的相互作用。其中遗传因素被认为是导致人类生精功能损伤的重要因素，在特发性少弱精子症男性不育患者中，约有60%被研究发现与遗传因素有关[3]。

谷胱甘肽S-转移酶（Glutathione S-transferases，GSTs）是一组具有解毒功能的蛋白超基因家族，属于机体Ⅱ相解毒酶系统，其中编码Mu，Theta和Pi亚型酶的GSTM1、GSTT1和GSTP1基因在人群中存在功能性基因遗传多态性[4]。该研究旨在探讨谷胱甘肽S-转移酶基因GSTM1、T1及P1基因多态性与特发性男性不育症的相关性。

资料与方法

一、材料

（一）研究对象

1. 纳入标准：按WHO第四版[5]标准常规进行2次或2次以上精液分析：睾丸体积在中国成人睾丸正常体积范围（15～25mL）；精液量≥2.0mL，精子密度＜20×106/mL且＞5×106/mL，A级精子百分率＜25%且（A+B）级精子百分率＜50%；正常形态精子＞30%（一般标准），外周血染色体（G显带）均为46, XY；外周血清卵泡生成素（FSH）、黄体生成素（LH）、泌乳素（PRL）、睾酮（T）水平在正常值范围；有规律性生活1年以上，未采取任何避孕措施女方未受孕；抗精子抗体检测阴性。

2. 正常对照组标准：健康生育男性既往1年内有生育史且目前性激素水平、精液分析等各项指标检查均未发现异常。

3. 排除标准：患者性生活异常，存在不射精或逆行射精等射精障碍；染色体异常、先天畸形、隐睾、睾丸发育不良、睾丸萎缩、损伤、精索静脉曲张、性腺功能减退症、白细胞精子症、输精管梗阻及生殖系统感染等；服用抗癫痫病、抗肿瘤、抗风湿及抗类风湿等有碍生精及精子活力的药物者；排除合并心血管、肝、肾和造血系统等严重原发性疾病、代谢性疾病、精神病患者，吸烟（每天吸烟在10支以上，持续半年以上）及酗酒（每天酗酒50mL（纯乙醇含量）以上，持续半年以上）者，以及患者本人或家属不同意参加并未签订临床研究协议者。通过以上纳入及排除标准，共有246例患者及117例对照纳入该项研究。

（二）主要试剂及仪器

全血基因组提取试剂盒购自美国Ax y ge n biosciences公司，2×PCR Mixture 购自立陶宛MBI公司。Biomltra梯度PCR仪为德国Sigma公司产品，凝胶成像分析系统为美国BioRad公司。

二、方法

（一）引物设计和合成

根据基因序列，采用prime5软件设计PCR扩增引物GSTM1：Forward 5'-GAA CTC CCT GAA AAG CTA AAG C-3'，Reverse 5'-GTT GGG CTC AAA TAT ACG GTG G-3'，扩增产物长度219bp；GSTT1：Forward 5'-TTC CTT ACT GGT CCT CAC ATC TC-3'，Reverse 5'-TCA CCG GAT CAT GGC CAG CA-3'，扩增产物长度480 bp；GSTP1：Forward 5'-ACC CCA GGG CTC TAT GGG AA-3'，Reverse 5'-TGA GGG CAC AAG AAG CCC CT-3'，扩增产物为177bp；β-actin为内参照，引物序列为：Forward 5'-ACT CCC CAT CCC AAG ACC-3', Reverse 5'- CCT TAA TGT CAC GCA CGA T-3'，扩增产物长度为400bp。引物由上海生物工程公司合成。

（二）外周血标本采集和基因组DNA提取

采取所有研究对象外周静脉血3mL并以乙二胺四乙酸二钠（EDTA）作为抗凝剂混匀为抗凝血液，放置于-80℃低温冰箱备用。基因组DNA提取按照外周血微量基因组DNA提取试剂盒说明书操作，所提取DNA放置于-20℃冰箱备用。

（三）GSTs基因型PCR扩增

采用Biomltra梯度PCR仪对所有DNA标本进行GSTM1、T1及P1基因型检测。反应体系为25μL（2 ×PCR Mixture 12.5μL，双蒸水8.5μL，各引物量为0.5μL，浓度1. 0μmol/L，DNA模板2μL，浓度为100μg/μL）。反应条件为95℃预变性5min；94℃变性30 s，60℃（63℃，58℃）退火30 s，72℃延伸30 s，共30个循环；72℃延伸7 min[6]。GSTP1基因PCR扩增产物采用BsmAI（ALW26I）限制性内切酶进行处理。

（四）电泳检测

PCR扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳，采用凝胶成像系统进行检测。GSTM1基因型检测结果以能扩增出219bp片断为GSTM1（+），否则为GSTM1（-），GSTM1基因型检测结果以能扩增出480bp片断为GSTT1（+），否则为GSTT1（-），并可见扩增产物为400bp的β-actin，GSTP1基因野生型基因经酶切后产物为177 bp，突变纯合型基因经酶切后产物为87 bp及90 bp，突变杂合型酶切后产物为177bp、87 bp及90 bp。所有样本均重复3次PCR扩增及电泳检测。

三、统计学分析

表1 谷胱甘肽S-转移酶（GSTM1、T1、P1）基因遗传多态性在正常对照组及病例组中频率分布

结 果

一、GSTM1基因遗传多态性与特发性男性不育症相关性

研究发现GSTM1（-）和GSTM1（+）基因型频率分布在正常对照组分别为41.88%和58.12%；而在特发性少弱精子症不育患者组分别为60.57%和39.43%。病例组GSTM1（-）基因型分布明显高于正常对照组（OR=2.132；95%CI=1.363-3.335；P=0.001），见表1和图1。

二、GSTT1基因遗传多态性与特发性男性不育症相关性

研究发现GSTT1（-）和GSTT1（+）基因型频率分布在正常对照组分别为47.86%和52.14%；而在特发性少弱精子症不育患者组分别为62.60%和37.40%。病例组GSTT1（-）基因型分布明显高于正常对照组（OR=1.832；95%CI=1.168-2.846；P=0.008），见表1和图2。

三、GSTM1/T1基因遗传多态性与特发性男性不育症相关性

研究发现GSTM1/T1（+/+）、（+/-）、（-/+）及（-/-）基因型频率分布在正常对照组为24.79%、33.33%、27.35%及14.53%；而在特发性少弱精子症不育患者组分别为15.45%、23.98%、21.95%及38.62%；GSTM1/T1（-/-）基因型病例组的频率分布明显高于正常对照组（OR=3.701；95%CI=2.083-6.575；P＜0.0001），见表1和图3。

图1 GSTM1基因遗传多态性水平凝胶电泳图

图2 GSTT1基因遗传多态性水平凝胶电泳图

图3 GSTM1/T1基因遗传多态性水平凝胶电泳图

四、GSTP1基因遗传多态性与特发性男性不育症相关性

研究发现GSTP1（A/A）及GSTP1（A/G+G/G）基因型频率分布在正常对照组分别为72.65%和27.35%；而在特发性少弱精子病不育患者组分别为67.89%和32.11%；谷胱甘肽S-转移酶P1（A/G+G/ G）基因型频率分布与正常对照组相比无明显差异（OR=1.257；95%CI=0.772-2.0445；P=0.847），见表1和图4。

图4 GSTP1基因RFLP-PCR产物水平凝胶电泳图

讨 论

在过去20年间，多项研究均表明全世界人类精子数量和质量均出现严重的下降趋势，这将严重影响到男性人群未来的生育能力[7,8]。虽然导致男性精子质量下降的确切原因到目前仍不清楚，但遗传因素与环境因素的相互作用被认为是导致精液质量下降的最重要原因[9,10]。其中，遗传因素被认为是导致人类生精功能损伤的重要因素，然而到目前的研究仍未发现造成男性不育症的明确遗传因素[11]，在特发性少弱精子性男性不育症患者中，约60%被研究发现与遗传因素有关，且有多种基因遗传多态性可能与睾丸精子生成功能受损存在密切关系[12]。

谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）是一组具有解毒功能的蛋白超基因家族，属于机体Ⅱ相解毒酶系统，其参与细胞对外源性化学物质以及人工合成有机物质解毒的各个生理阶段，可分为胞浆型、胞膜型、线粒体型和白三烯C4合成酶[13]。其中水溶性GSTs目前又分为8个亚型，即：Alpha，Mu，Kappa，Omega，Pi，Sigma，Theta和Zeta。这些亚型分别由GSTA，GSTM，GSTK，GSTO，GSTP，GSTS，GSTT和GSTZ基因编码[14,15]。Safarinejad等[16]对伊朗166例有生育史正常健康男性对照和166例特发性少弱畸形精子症（OAT）患者的GSTs基因遗传多态性分布研究后发现：GSTM1（-）或GSTT1（-）基因型可增加男性患不育症的风险；当GSTP1基因野生型（AA）合并GSTM1（-）或GSTT1（-）基因型时均可增加患男性不育症的风险，当GSTM1/T1（-/-）基因型并GSTP1（Ile/Ile）时，将极大增加患男性不育症的风险，然而GSTP1基因突变型（Val/Ile或Val/Val）却降低患男性不育症的风险。Salehi等[17]对来源于伊朗北部的150例男性不育症患者和200例健康对照男性GSTT1、GSTM1和CYP1A1*2A基因遗传多态性进行分析，结果发现GSTM1和GSTT1基因缺失型在特发性男性不育症组中的频率分别为61.0%和34.0%，而在正常健康对照中分别为33.0%和17.0%。GSTM1和T1基因均缺失型在男性不育症组中明显高于正常组。Aydos等[18]对110例男性不育症患者和105例有生育史正常健康男性进行病例-对照研究。发现GSTM1和CYP1A1*2C基因多态性分别与男性不育症之间存在密切关系。当一个患者为CYP1A1Val/Val（GG）或CYP1A1 Ile/Val（AG）基因型加GSTM1（-）时，其患男性不育症的危险度是CYP1A1 Ile/Ile（AA）加GSTM1（+）患男性不育症的6.90倍。通过既往多项研究我们发现机体谷胱甘肽S-转移酶解毒酶基因多态性在男性不育症致病因素中扮演着重要的角色，且不同的人群存在差异。

在该项研究中，我们发现GSTM1（-）分布频率在特发性少弱精子症不育患者组明显高于正常对照组（OR=2.132，P=0.001）；GSTT1（-）分布频率在特发性少弱精子症不育患者组明显高于正常对照组（OR=1.832，P=0.008）；同时，我们发现GSTM1/T1（-/-）基因型在病例组的频率分布明显高于正常对照组（OR=3.701，P＜0.0001），并发现GSTM1（-）及GSTT1（-）具有协同效应。然而，GSTP1（A/G+G/G）基因型频率分布在病例组及正常对照组相比无明显差异（OR=1.257，P=0.847），表明GSTP1基因多态性与特发性少弱精子症不育无明显相关性。因此，该研究发现GSTM1、GSTT1基因缺失型可能是是特发性男性不育症的危险因素，GSTP1基因突变型与特发性男性不育症患者无明显相关性。

1 World Health Organization. WHO manual for the standardized investigation and diagnosis of the infertile couple. Cambridge University Press 2000

2 Pasqualotto FF, Pasqualotto EB, Sobreiro BP,et al. Clinical diagnosis in men undergoing infertility investigation in a university hospital.Urol Int2006; 76(2): 122-125

3 Finotti AC, Costa E Silva RC, Bordin BM,et al. Glutathione S-transferase M1 and T1 polymorphism in men with idiopathic infertility.Genet Mol Res2009; 8(3): 1093-1098

4 Jiang S, Yu L, Cheng J,et al.Genomic damages in peripheral blood lymphocytes and association with polymorphisms of three glutathione S-transferases in workers exposed to formaldehyde.Mutat Res2010; 695(1-2):9-15

5 World Health Organization. WHO Laboratory Manual for the Examination of Human Semen and Sperm-Cervical Mucus Interactions. 4thed. Cambridge, United Kingdom: Cambridge University Press 1999

6 Tang K, Xue W, Xing Y,et al. Genetic polymorphisms of glutathione s-transferase M1, T1, and P1, and the assessment of oxidative damage in infertile men with varicoceles from northwestern china.J Androl2012; 33(2): 257-263

7 Comhaire FH, Mahmoud AM, Schoonjans F. Sperm quality, birth rates and the environment in Flanders (Belgium).Reprod Toxicol2007; 23(2):133-137

8 Carlsen E, Giwercman A, Keiding N,et al. Evidence for decreasing quality of semen during past 50 years.BMJ1992; 305(6854): 609-613

9 Wong WY, Thomas CM, Merkus JM,et al. Male factor subfertility: possible causes and the impact of nutritional factors.Fertil Steril2000; 73(3): 435-442

10 Skakkebaek NE, Giwercman A, de Kretser D. Pathogenesis and management of male infertility.Lancet1994; 343(8911): 1473-1479

11 Rybar R, Markova P, Veznik Z,et al. Sperm chromatin integrity in young men with no experiences of infertility and men from idiopathic infertility couples.Andrologia2009; 41(3):141-149

12 O'Flynn O'Brien KL, Varghese AC, Agarwal A. The genetic causes of male factor infertility: a review.Fertil Steril2010; 93(1): 1-12

13 Ketterer B. A bird's eye view of the glutathione transferase f eld.Chem Biol Interact2001; 138(1): 27-42

14 Lo HW, Ali-Osman F. Genetic polymorphism and function of glutathione S-transferases in tumor drugresistance.Curr Opin Pharmacol2007; 7(4):367-374

15 Strange RC, Spiteri MA, Ramachandran S,et al. Glutathione-S-transferase family of enzymes.Mutat Res2001; 482(1-2): 21-26

16 Safarinejad MR, Shaf ei N, Safarinejad S. The association of glutathione-S-transferase gene polymorphisms (GSTM1, GSTT1, GSTP1) with idiopathic male infertility.J Hum Genet2010; 55(9): 565-570

17 Salehi Z, Gholizadeh L, Vaziri H,et al. Analysis of GSTM1, GSTT1, and CYP1A1 in Idiopathic Male Infertility.Reprod Sci2012; 19(1):81-85

18 Aydos SE, Taspinar M, Sunguroglu A,et al.Association of CYP1A1 and glutathione S-transferase polymorphisms with male factor infertility.Fertil Steril2009; 92(2): 541-547

（2014-09-28收稿）

Correlative analysis of between glutathione S-transferase polymorphisms and idiopathic male infertility*

Tang Kaifa1, Xu Shaoyuan2, Zou Tiejun3, Ding Shangshu2,
Liu Ruizhe2, Wang Xinyang2, Tian Yuan1, Sun Fa1**, Xing Junping2**1. Department of Urology, the Aff liated Hospital of Guiyang Medical College; 2. Department of Urology,The First Aff liated
Hospital of Medical College of Xi 'an Jiaotong Universit y; 3. Department of Urology, Shaanxi People's Hospital

Xing Junping, E-mail: xingjpcn@gmail.com; Sun Fa, E-mail: sfguizhou@163.com

ObjectiveTo investigate the relationship between glutathione S- transferase enzyme gene GSTM1, T1 and P1 gene polymorphism and idiopathic male infertility.MethodsTotal of 246 patients with idiopathic male infertility and 117 healthy normal control were enrolled in the case-control study. Polymerase chain reaction (PCR) and polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) were used here to identify the genotype of GSTM1, GSTT1 and GSTP1.ResultsThe frequency of glutathione S- transferase M1 (-)genotype in the normal control group and idiopathic male infertility were 41.88% and 60.57%, with signif cant difference (P=0.001); and the frequency of glutathione S-transferase T1(-)genotype in the normal control group and idiopathic male infertility patients were 47.86% and 62.60%, withsignif cant difference (P=0.008); and the frequency of glutathione S- transferase M1/T1 (-/-) genotype in the normal control group and idiopathic male infertility patients were 14.53% and 38.62%, with significant difference (P<0.001); however the frequencies of glutathione S- transferase P1 gene mutation type in normal control group and idiopathic male infertility patients were 27.35% and 32.11%, with no signif cant difference (P=0.847). Conclution This study suggestd that GSTM1, GSTT1 gene deletion type may be the risk factors of idiopathic male infertility, but GSTP1 gene mutation types is not associated with idiopathic male infertility.

male infertility; glutathione S-transferase; polymorphism

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.11.001

R 698.2

资助: 国家自然科学基金（No. 81300541）; 贵州省度科学技术基金计划项目（No. 黔科合J字[2013]2051号）
**共同通讯作者: 邢俊平, E-mail: xingjpcn@gmail.com; 孙发, E-mail: sfguizhou@163.com