糖脂清颗粒对2型糖尿病大鼠心肌组织AT1R表达影响的实验研究

顾震宇王旭洪兵尚文斌滕士超徐奚如俞晶华

（1.南京中医药大学，江苏南京 210023；2.南京中医药大学附属淮安中医院，江苏淮安 223001；3.江苏省中医院，江苏南京 210029）

糖脂清颗粒对2型糖尿病大鼠心肌组织AT1R表达影响的实验研究

顾震宇1王旭1洪兵2尚文斌1滕士超3徐奚如3俞晶华1

（1.南京中医药大学，江苏南京 210023；2.南京中医药大学附属淮安中医院，江苏淮安 223001；3.江苏省中医院，江苏南京 210029）

目的：观察糖脂清颗粒对2型糖尿病大鼠心肌组织血管紧张素Ⅱ1型受体（AT1R）蛋白和mRNA表达的影响，探讨其干预2型糖尿病大鼠心肌纤维化的机制。方法：雄性SD大鼠，采用高糖高脂饲料和一次性小剂量（30mg/kg）2%链脲佐菌素（STZ）溶液腹腔注射制作2型糖尿病模型。将模型大鼠分为模型组、厄贝沙坦组和糖脂清颗粒高、中、低剂量组，另取5只正常大鼠设为正常组，分别给药或生理盐水8周后，检测心肌组织AT1R蛋白及mRNA的表达。结果：糖脂清高、中剂量组大鼠心肌组织AT1R蛋白及mRNA表达明显低于模型组，糖脂清低剂量组AT1R mRNA表达也较模型组显著降低。结论：糖脂清颗粒通过抑制心肌组织AT1R蛋白及mRNA的表达，抑制糖尿病大鼠心肌纤维化的发展。

糖脂清颗粒 糖尿病心肌纤维化 AT1R 实验研究

糖尿病心肌病是糖尿病心脏病的一类特异性病变。目前研究认为，心肌间质纤维化在糖尿病心肌病的发生发展中起着重要的作用，而心肌间质纤维化可能与肾素-血管紧张素系统激活（RAS）、细胞因子、内皮素等多种因素有关。本研究以心肌组织的血管紧张素Ⅱ1型受体（AT1R）为切入点，探讨糖脂清颗粒对2型糖尿病大鼠心肌纤维化的作用机制。

1 实验材料

1.1 实验动物健康SD雄性大鼠，清洁级，4～5周龄，体重180～220g，由南京中医药大学动物实验中心提供，许可证：scxk浙20080033。每笼3只，分笼饲养，湿度40%～60%，室温16～26℃。

1.2 主要药物和试剂糖脂清颗粒（药物组成：黄精、枸杞、泽兰、僵蚕、鬼箭羽等），南京中医药大学附属医院制剂室制备提供。厄贝沙坦片（0.15g/片），赛诺菲（杭州）制药有限公司，国药准字：J20080061。高糖高脂饲料由南京中医药大学动物试验中心提供。拜安捷2血糖仪及血糖试纸条（拜耳公司），链脲佐菌素（STZ，美国Sigma公司），蛋白定量试剂盒（BIO-RAD公司），牛血清白蛋白（Sigma公司），兔抗鼠AT1R、β-actin单克隆抗体（美国Santa cruz公司），过氧化物酶标记的羊抗兔二抗（丹麦Dako公司），Western Blotting Electro Chemiluminescence（Amersham公司），总RNA提取试剂Trizol reagent（美国Invitrogen公司），分子量标准品DNA marker（DL2000bp，大连TaKaRa公司），逆转录酶M-MLV和Oligo（dT）引物（美国Promega公司），PCR所需试剂（日本TaKaRa公司）。

2 实验方法

2.1 造模与分组大鼠适应性喂养1周后，以高脂高糖饲料喂养，喂养8周后一次性2%链脲佐菌素（STZ）溶液30mg/kg腹腔注射，3d后尾尖采血，测随机血糖≥16.7mmol/L确定为糖尿病模型大鼠。

选取5只正常大鼠作为正常组；2型糖尿病模型大鼠随机分为5组，模型组、厄贝沙坦组和糖脂清高、中、低剂量组。中药剂量按人体重70kg，大鼠平均体重500g体表面积计算。模型组及正常组灌服生理盐水1m L/100g，糖脂清高、中、低剂量组给药药量分别为19.4、9.7、4.85g/（kg·d），厄贝沙坦组给药剂量为10mg/（kg·d）。各组大鼠每日固定时段灌胃给药1次，连续用药8周。

2.2 心肌组织样本的制备用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉迅速开胸取出心脏，以冰生理盐水冲洗干净，去除大血管、心房、右心室，快速切留适量心尖组织，经液氮速冻后，冻存于-80℃冰箱中。

2.3 Western Blotting检测大鼠心肌组织AT1R蛋白的表达

提取大鼠心肌总蛋白，采用BCA法测定样品蛋白质的浓度，进行SDS-PAGE转膜，转膜完毕后，用PBS-T洗膜2次，5min/次。使用阻断剂37℃孵育1h，置于1∶1000稀释的特异性抗体反应液，4℃过夜。弃一抗，用PBS-T洗膜3次，5m in/次。加入含1∶5000稀释的过氧化物酶酶联二抗反应液，37℃摇动孵育2h。化学发光、显影和定影，显影之后分析所测电泳条带的性质。β-Actin作为内参照。

2.4 RT-PCR检测大鼠心肌组织AT1R mRNA的表达取心肌组织进行mRNA的提取，经鉴定浓度和纯度符合实验要求后，进行cDNA第一链合成，取5μL RNA加入2μL的oligo（dT）15，70℃温浴5min后，立刻取出至冰上冷却，加入反转录体系（5×RT buffer 5μL，dNTP 1.25μL，RNA酶抑制剂0.625μL，M-MLV反转录酶1μL，无菌水10.125μL），总体积为25μL，37℃温育60min，再70℃、15min灭活反转录酶的活性，反转录成cDNA之后4℃保存备用。根据Gene Bank数据库中mRNA序列，用Primer5软件设计相关引物。PCR反应体系：模板，8μL；正反义引物各1μL；10倍浓度buffer（含Mg2+）2.5μL；10mmol/L dNTP 0.5μL；ddH2O 11.5μL；Taq酶0.5μL。总共25μL。PCR反应条件：第一阶段95℃，5m in，预变性；第二阶段，94℃、30s，56℃、35s，72℃、45s，共35个循环；第三阶段，72℃，10min，4℃，保存。β-Actin作为内参照。PCR扩增引物序列见表1。

2.5 统计学方法全部数据采用SPSS11.0统计软件分析。计量资料用（±s）表示，多组间比较用单因素方差分析和q检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 各组大鼠心肌组织AT1R蛋白的表达见表1，图1。模型组大鼠心肌组织AT1R表达明显增加，与正常组相比有显著性差异（P＜0.01）；糖脂清高、中剂量组大鼠心肌组织AT1R的表达明显低于模型组（P＜0.01）；糖脂清低剂量组与模型组相比降低，但无显著性差异（P＞0.05）；糖脂清各剂量组与厄贝沙坦组相比无明显差异（P＞0.05）。

图1 各组大鼠心肌组织AT1R蛋白表达

表2 各组大鼠心肌组织AT1R蛋白表达的比较（±s）

表2 各组大鼠心肌组织AT1R蛋白表达的比较（±s）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，▲▲P＜0.01。

组别动物数（只）AT1R正常组50.57±0.17模型组5 1.05±0.18**厄贝沙坦组5 0.62±0.18▲▲糖脂清高剂量组5 0.62±0.13▲▲糖脂清中剂量组5 0.67±0.14▲▲糖脂清低剂量组5 0.80±0.14

3.2 各组大鼠心肌组织AT1R mRNA的表达见图2、表2。模型组大鼠心肌组织AT1R mRNA表达明显增加，与正常组相比有显著性差异（P＜0.01）；糖脂清高、中剂量组大鼠心肌组织AT1R mRNA的表达显著低于模型组（P＜0.01）；糖脂清低剂量组与模型组相比也明显降低（P<0.05）；糖脂清各剂量组与厄贝沙坦组相比无明显差异（P＞0.05）。

图2 心肌组织AT1R基因表达

表3 各组大鼠心肌组织AT1R mRNA表达的比较（±s）

表3 各组大鼠心肌组织AT1R mRNA表达的比较（±s）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

组别动物数（只）AT1R模型组5 0.89±0.05**厄贝沙坦组5 0.60±0.11▲▲糖脂清高剂量组5 0.62±0.14▲▲糖脂清中剂量组5 0.68±0.09▲▲糖脂清低剂量组5 0.73±0.10▲正常组50.49±0.08

4 讨论

本实验采用的造模方法和药物干预疗程（8周），参考了文献[1-5]关于2型糖尿病大鼠心肌病变的研究而制定。糖尿病大鼠心肌病变的产生一般发生在造模成功后6～8周。朱禧星等[1]发现，在STZ造模成功糖尿病大鼠4周病程时，糖尿病大鼠心肌线粒体开始肿胀变性，8周时心肌酶含量明显降低，心肌病变显著，心肌排列不齐、断裂和心肌收缩带形成等。张芳林等[2]观察心肌超微结构，证实2型糖尿病大鼠心脏病变出现于模型建立后1.5个月，并随着病程延长而加重。另有国外文献报道，STZ诱导糖尿病大鼠心肌细胞超微结构的改变在8～12周，心功能改变发生在6～14周[3-5]。

血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）是肾素-血管紧张素系统（RAS）的主要活性肽，通过组织细胞膜上的AT1R来发挥生理学作用，并与TGF-β1、CTGF、ET之间相互作用，共同促进糖尿病心肌病的发生和发展。通过与AngⅡ结合，AT1R被激活，促进尼克酰胺腺嘌呤二核苷（NADPH）氧化酶合成ROS，并进一步激活下游的核因子-κB（NF-κB）信号蛋白发挥生物学作用，其可能的机制有如下3点：（1）促进细胞间黏附分子-1（ICAM-1）和血管细胞黏附1（VCAM-1）的生成，引起血管内皮损伤，并且通过ERK促进内皮素（ET）的表达，引起血管的收缩；AngⅡ调节ET-1及细胞外基质（ECM）表达，促进了心肌肥厚和纤维化[6]。（2）通过激活转化生长因子（TGF-β1）、结缔组织生长因子（CTGF）蛋白活性诱导心肌细胞肥厚、凋亡及间质纤维化，导致心脏主动和被动舒张功能损伤[7]。（3）AngⅡ与心肌成纤维细胞上的AT1受体结合还能刺激心肌成纤维细胞增生，导致心肌间质胶原合成增加[8]。

糖尿病心肌病属于中医“消渴”“心悸”“胸痹”等范畴，主要由消渴病日久迁延所致。导师王旭教授根据中医“瘀热”和“久病入络”的理论，认为其基本病机是气阴两虚、痰瘀阻络，并确立了“益气养阴、化痰祛瘀”的治疗原则，创立了中药复方糖脂清颗粒，用于糖尿病心肌病的防治。

本实验采取Western Blotting和RT-PCR的实验方法，观测糖脂清颗粒对AT1R的影响，发现糖脂清颗粒对2型糖尿病大鼠心肌AT1R蛋白及其mRNA的表达有抑制作用，该作用与厄贝沙坦相比无明显差异，因此，糖脂清颗粒具有类似厄贝沙坦抑制AT1R的作用，从而影响下游通路，抑制心肌纤维化的发展。

[1]朱禧星，周晓朋，何德华，等.链脲佐菌素糖尿病大鼠的心脏病变.中华内分泌代谢杂志，1992，8（4）：222

[2]张芳林，李果.2型糖尿病性心脏病变早期相关基因的筛选和分析.中华内科杂志，2002，41（8）：530

[3]Ed W Thompson.Structuralmanifestations of diabetic cardiomyopathy in the rat and its reversal by insulin treatment. American Journal of Anatomy，1988，182（3）：270

[4]Fein FS，Kornstein LB，Strobeck JE，et al.Altered myocardial mechanics in diabetic rats.Circ Res，1980，47（6）：922

[5]Tahiliani AG，Vadlamudi RV，McNeill JH.Prevention and reversal of altered myocardial function in diabetic rats by insulin treatment.Can J Physiol Pharmacol，1983，61（4）：516

[6]Copaja Soto M，Valenzuela R，Saldana A，et al.Early expression of monocyte chemoattractant protein-1 correlates with the onset of isoproterenol-induced cardiac fibrosis in rats with distinct angiotensin-converting enzyme polymorphism.JRenin Angiotensin Aldosterone Syst，2008，9（3）：154

[7]Connelly KA，Kelly DJ，Zhang Y，et al.Functional，structural and molecular aspects of diastolic heart failure in the diabetic（mRen-2）27rat.Cardiovasc Res，2007，76（2）：280

[8]Dong B，Yu QT，Dai HY，et al.Angiotensin-converting enzyme-2 overexpression impr-oves left ventricular remodeling and function in a rat model of diabetic cardiomyopathy.J Am Coll Cardiol，2012，59（8）：739

R587.105

：A

：1672-397X（2014）12-0083-03

顾震宇（1981-），男，博士研究生，讲师，研究方向：中西医结合治疗内分泌与代谢病。

王旭，njzywangxu@126.com

2014-08-15

编辑：吴宁

江苏省科技厅自然科学基金项目（BK2011817）；国家教育部博士点基金资助项目（20133237110004）