不同类型糖源对大菱鲆脂肪代谢酶活性和脂肪酸组成的影响＊

苗惠君，聂琴，苗淑彦，陈尘悦，李静，张文兵＊＊，麦康森

（1.中国海洋大学水产动物营养与饲料农业部重点实验室，山东 青岛266003；2.中国石油大学（华东）生物技术与生物工程中心，山东 青岛266580）

糖类作为饲料中最廉价的能量来源，不仅为动物的代谢活动提供能量，也是合成体脂的重要原料[1]。Hemre等[2]的研究表明，肝脏是鱼类合成脂肪的主要场所，肝脏中的糖类有控制脂肪合成的作用。然而，不同类型的糖源对鱼类脂肪代谢的影响不同，例如葡萄糖和麦芽糖比结构复杂的多糖更有利于高首鲟（Acipensertransmontanus）鱼体脂肪的合成[3]；不同类型的糖源能够影响银鲫（Carassiusauratusgibelio）和中国长吻鮠（LeiocassislongirostrisGünther）的糖异生和脂肪合成代谢[4]。放射性同位素标记葡萄糖显示，参与从头合成脂质的糖类相当有限[5]。饲料中糖类促进机体脂肪重新合成主要通过增加还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）的量，而不是通过为脂肪提供碳架[6]。饲料中不同类型的糖源对鱼体脂肪酸的组成也会产生影响，Degani等[7]的研究表明，欧洲鳗鲡（Anguillaanguilla）体脂肪酸的组成受饲料中不同糖源的影响。

大菱鲆（Scophthalmusmaximus）属于硬骨鱼纲（Osleichthyes）、鲽形目（Pleuronectiformes）、鲽亚目（Pleuronectoidei）、鲆科（Bothidae）、菱鲆属 （Scophthalms），为原产于欧洲的名贵海水养殖品种[8]。自1992年引入我国以来，成为我国海水养殖中的一个重要鱼类。大菱鲆为肉食性鱼类，虽然肉食性鱼类对饲料中糖类的利用率较差[9]，但饲料中适量的糖类可以提高条纹鲈（Moronechrysop♀×M.saxatilis♂）、牙鲆 （Paralichthysolivaceus）等肉食性鱼类的增重率[10－11]。Nijhof等[12]的研究表明大菱鲆在糖类的代谢中没有任何系统性缺陷。马爱军等[13]认为大菱鲆幼鱼对饲料中糖的需求量为4%，并认为虽然大菱鲆对糖类的需求量较少，但适量的糖类对幼鱼的生长和饲料利用等方面起到了一定的作用。然而，不同类型的糖源对大菱鲆幼鱼脂肪代谢的影响尚不清楚。本研究拟通过分析大菱鲆幼鱼摄食不同类型的糖源后，体内与NADPH的生成和脂肪分解代谢相关酶的活性，以及肌肉脂肪酸组成的变化，为阐明不同类型糖源对大菱鲆脂肪代谢的影响机制提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 实验饲料配方和制作

以白鱼粉、酪蛋白和明胶为主要蛋白源，以鱼油和大豆卵磷脂为主要脂肪源，分别添加5%的葡萄糖（单糖），蔗糖（双糖），糊精（多糖）（见表1），配制成3种含不同类型糖源的半精制实验饲料。饲料原料粉碎过80目筛后，按逐级放大法混合均匀，加鱼油搅拌均匀后加水制成一定硬度的面团，用双螺杆挤压机压出颗粒（1.5 mm×3.0mm）饲料，50℃烘箱烘干后放于－20℃冰箱内保存备用。

表1 实验饲料配方及营养成分（干物质）Table 1 Formulation and proximate compositions of the experiment diets /%

1.2 实验动物及饲养管理

实验用大菱鲆为山东省青岛胶南育苗场当年人工孵化的同一批鱼苗，养殖实验在中国海洋大学鳌山卫实验基地进行。实验开始前，鱼苗在室内流水式养殖系统内暂养2周，以商品饲料饱食投喂，使之逐渐适应养殖环境和人工配合饲料。暂养结束后停食24h，挑选体格健壮、规格均一的大菱鲆幼鱼（8.77±0.16）g进行分组。共3个处理，每个处理3个重复，每个聚乙烯水族箱（500L）为1个重复，放养密度为28尾/箱。实验期间每日饱食投喂2次（07：00，18：00），每日投喂后吸残饵以保持水质。养殖实验持续9周，期间水温（19±1）℃，pH＝7.7±0.1，盐度25.2±1，溶氧含量≥7.0mg/L。

1.3 取样及样品分析

实验结束前，停喂实验鱼24h，每桶随机取3尾大菱鲆，在冰上取其背部肌肉，－20℃保存，用于肌肉脂肪酸组成的测定；另在每桶随机取3尾冰上迅速解剖，取肝脏、肠道，液氮速冻，后转到－80℃保存，用于测定相关酶的活性。

1.3.1 饲料常规成分测定 饲料样品按照AOAC[14]方法进行生化组成分析。其中，水分含量测定于105℃烘至恒重；粗蛋白采用半微量凯氏定氮法（总氮×6.25）；粗脂肪采用索氏抽提法；灰分测定于马福炉中550℃下灼烧至恒重；总能用氧弹仪（Parr 6100，USA）测定；实验饲料中糖含量以饲料中可利用糖含量计量，采用蒽酮比色法测定[15]。

1.3.2 相关酶活性测定 肠道的脂肪酶（LPS），肝脏的脂蛋白脂酶（LPL）、肝脂酶（HL）活性的测定均采用试剂盒（南京建成生物工程研究所），按试剂盒说明书操作。肝脏的葡萄糖－6－磷酸脱氢酶（G6PD）活性的测定，参考蒋传葵等[16]的方法。肝脏的苹果酸酶（ME）活性的测定，参考Wise等[17]所用的方法。

脂肪酶活性单位的定义：在37℃条件下，每克组织蛋白在反应体系中与底物反应1min，每消耗1μmol底物为1个酶活力单位。

脂蛋白脂酶和肝脂酶活性单位的定义：每毫克组织蛋白每小时在反应体系中所产生1μmol的游离脂肪酸（FFA）为1个酶活力单位。

总脂酶活性＝脂蛋白脂酶活性＋肝脂酶活性。

葡萄糖－6－磷酸脱氢酶、苹果酸酶活性单位的定义为：每毫克组织蛋白在反应体系中1min内催化1nmol的NADP转化NADPH定义为1个酶活力单位。

1.3.3 肠道和肝脏组织匀浆液蛋白含量测定 采用微量考马斯亮兰法测定肠道和肝脏组织匀浆液中的蛋白质含量，试剂盒购自南京建成生物工程研究所，测定过程按照试剂盒说明书操作。

1.3.4 脂肪酸测定 肌肉中脂肪酸组成的测定参照徐玮[18]的方法。气相色谱仪：美国惠普公司HP6890型；毛细管柱：007－CW；柱温：150℃（1min）经15℃/min到200℃，再经2℃/min升至250℃；汽化室温度：270℃；检测器温度：270℃。数据处理：采用面积归一法定量。

1.4 计算及统计

采用SPSS 17.0软件对所得数据进行单因素方差（ANOVA）分析，若差异显著，则进行Tukey多重比较，显著性水平为P＜0.05，实验数据用平均值±标准误（X ±S.E）表示。

2 结果

2.1 不同类型的糖源对大菱鲆脂肪合成相关酶活性的影响

饲料中不同类型的糖源显著（P＜0.05）影响了大菱鲆葡萄糖－6－磷酸脱氢酶的活性（见表2）。糖源为葡萄糖时，肝脏中葡萄糖－6－磷酸脱氢酶的活性最高（40.18±0.68）nmol·min－1·mg－1Prot.，显著高于其他处理组；该酶的活性在蔗糖和糊精处理组之间没有显著差异。苹果酸酶的活性在饲料糖源为葡萄糖时显著（P＜0.05）高于其他处理组；该酶的活性在蔗糖和糊精处理组之间没有显著差异（见表2）。

表2 不同类型糖源对大菱鲆脂肪合成相关酶活性的影响Table 2 Effects of different dietary carbohydrate complexity on lipogenic enzymes of turbot

2.2 不同类型的糖源对大菱鲆脂肪分解相关酶活性的影响

大菱鲆肠道脂肪酶的活性受饲料中不同类型糖源的显著（P＜0.01）影响（见表3）。糖源为糊精时，脂肪酶的活性最高（21.11±0.36）U/g Prot.，显著高于其他处理组；该酶活性在葡萄糖和蔗糖处理组之间没有显著差异。饲料中不同类型的糖源显著（P＜0.05）影响了大菱鲆肝脏中脂蛋白脂酶的活性（见表3）。糖源为葡萄糖时，脂蛋白脂酶的活性为（0.30±0.02）U/mg Prot.，显著低于其他处理组；该酶活性在蔗糖和糊精处理组之间没有显著差异。饲料中添加不同类型的糖源对大菱鲆肝脏中肝脂酶的活性没有显著影响（P＞0.05），但该酶活性随着糖源结构复杂程度的增加呈现上升的趋势（见表3）。大菱鲆肝脏总脂酶的活性受饲料添加不同类型糖源的显著（P＜0.05）影响（见表3）。糖源为糊精时，总脂酶的活性最高（0.96±0.04）U/mg Prot.，显著高于糖源为葡萄糖的组。

表3 不同类型的糖源对大菱鲆脂肪分解相关酶活性的影响Table 3 Effects of different dietary carbohydrate complexity on lipolytic enzymes of turbot

2.3 不同类型的糖源对大菱鲆肌肉脂肪酸组成的影响

饲料中以葡萄糖为糖源的处理组，大菱鲆肌肉饱和脂肪酸中的C16∶0和C18∶0的含量均显著（P＜0.05）高于以糊精为饲料糖源的处理组，但是饲料中的不同糖源对C14∶0和C20∶0含量无显著（P＞0.05）影响（见表4）。肌肉单不饱和脂肪酸中的C16∶1和C18∶1的含量均受不同类型糖源的显著（P＜0.05）影响，糊精组显著高于葡萄糖组（见表4）。饲料中不同类型的糖源对C18∶2n－6、C18∶3n－3、ARA、EPA、DHA 的含量无显著（P＞0.05）影响。

表4 不同类型的糖源对大菱鲆肌肉中脂肪酸组成的影响Table 4 Effects of different dietary carbohydrate complexity on fatty acid compositions in the muscle of turbot

3 讨论

苗淑彦等的研究表明，饲料中分别添加5%的葡萄糖、蔗糖或糊精对大菱鲆幼鱼的特定生长率的影响，这三者之间没有显著差异，其变化范围为2.05～2.10（%/d）。蔗糖组（0.82）大菱鲆的饲料系数显著高于葡萄糖组（0.76），而与糊精组（0.78）没有显著差异；葡萄糖组（0.76）饲料系数与糊精组（0.78）没有显著差异（未发表数据）。

3.1 不同类型的糖源对大菱鲆脂肪合成的影响

鱼类脂肪酸的合成主要在肝脏中进行。NADPH是合成脂肪酸所必需的原料，主要由葡萄糖－6－磷酸脱氢酶通过磷酸戊糖途径（葡萄糖氧化分解的一种方式）产生，或由苹果酸酶催化苹果酸氧化脱羧生成丙酮酸的过程中产生。因此，葡萄糖－6－磷酸脱氢酶和苹果酸酶是参与脂肪合成的重要酶[19]。本研究中饲料糖源为葡萄糖时，大菱鲆肝脏中葡萄糖－6－磷酸脱氢酶和苹果酸酶的活性显著高于其他处理组，而蔗糖和糊精处理组之间没有显著差异。Cui等[20]对军曹鱼（Rachycentroncanadum）幼鱼的研究表明，饲料中糖源为葡萄糖的处理组中葡萄糖－6－磷酸脱氢酶的活性比糖源为蔗糖、麦芽糖、糊精、玉米淀粉、小麦淀粉的处理组活性都要高。Hung等[3]对高首鲟（Acipensertransmontanus）的研究也表明，以葡萄糖为糖源的处理组中葡萄糖－6－磷酸脱氢酶和苹果酸酶的活性均比其他糖源的处理组高。同样的结果在虹鳟（Oncorhynchusmykiss）的研究中也得到证实[21]。这些研究结果表明，葡萄糖比结构复杂的糖源更能促进鱼体内脂肪的合成代谢。与摄入蔗糖、糊精等复杂度较高的糖源相比，鱼体在摄入葡萄糖后，血糖含量更快的达到最高点而且高血糖的持续时间最短[22－25]，这就要求鱼体增强其相应的葡萄糖代谢转运机制，如本研究中葡萄糖－6－磷酸脱氢酶和苹果酸酶活性的增加产生了更多的NADPH，从而增强了脂肪的合成作用，以此来作为调节高血糖的途径之一。

3.2 不同类型的糖源对大菱鲆脂肪分解的影响

脂蛋白脂酶是脂蛋白代谢的关键酶，主要生理功能是催化极低密度脂蛋白和乳糜微粒所携带的甘油三酯水解转变成为甘油和脂肪酸，以供各种组织储存和利用[26]。本研究表明饲料中糖源为葡萄糖时，大菱鲆肝脏中脂蛋白脂酶的活性显著低于其他处理组，该酶的活性在蔗糖和糊精处理组之间没有显著差异。肝脂酶主要在肝脏中合成，作用于乳糜微粒、极低密度脂蛋白代谢残粒及高密度脂蛋白中的甘油三酯和磷脂的代谢[27]。本研究表明饲料中添加不同类型的糖源对大菱鲆肝脏中肝脂酶的活性没有显著影响，但肝脂酶的活性随着糖源结构复杂程度的增加呈现上升的趋势。肝脂酶和脂蛋白脂酶是鱼类肝胰脏中参与脂肪分解的2种关键酶，合称为总脂酶[28]。本研究结果表明，当饲料糖源为糊精时，大菱鲆肝脏总脂酶的活性显著高于葡萄糖组。

通过对脂肪分解相关酶活性的分析可知，葡萄糖组的相关酶活性较其他组低。由此可推测复杂度高的糖源（如糊精）比葡萄糖易于被大菱鲆和某些鱼类利用[10，29－34]的原因表现在2个方面，一方面罗毅平等[35]认为的由于复杂度高的糖类需要先水解为单糖才能被消化道吸收，因此复杂度高的糖类的吸收速率比单糖慢，鱼体有足够的时间调高糖类的分解转化速率，从而减轻了糖吸收速率过剩的负效应。另一方面，由于复杂度高的糖源通过刺激脂肪分解相关酶的活性，加强了脂肪的分解供能作用，提高了鱼体对饲料的利用效率，同时也降低了鱼体脂肪过度沉积可能会引起疾病的风险。

3.3 不同类型的糖源对大菱鲆肌肉脂肪酸组成的影响

在脂类的合成过程中，首先由来自糖代谢的产物乙酰CoA合成软脂酸C16∶0，然后通过碳链的加长或缩短合成其他的脂肪酸，进而合成甘油三酯[1]。饲料中以葡萄糖为糖源时，大菱鲆肌肉饱和脂肪酸中的C16∶0和C18∶0的含量均显著高于以糊精为糖源的组。本研究中，在饲料脂肪酸来源一致的情况下，这种差异说明大菱鲆利用葡萄糖合成脂类的能力强于利用结构复杂的糖源，这与本研究中脂肪合成相关酶活性的分析结果一致。单不饱和脂肪酸是指含有一个双键的脂肪酸，在鱼油中的含量较多[36]。肌肉单不饱和脂肪酸中的C16∶1和C18∶1的含量均受不同类型糖源的显著影响，糊精组显著高于葡萄糖组，说明糊精为糖源时，能促进大菱鲆体内饱和脂肪酸的去饱和作用，从而增加不饱和脂肪酸的积累。必需脂肪酸是指不能被机体合成或者合成能力不足，而又是生物体生命所必需，必须由食物供给的脂肪酸[37]。n－3高不饱和脂肪酸，特别是ARA、EPA和DHA是鲆鲽鱼的必需脂肪酸[38]。本研究中，饲料不同类型的糖源对肌肉中ARA、EPA和DHA的含量均无显著影响。由此可见，饲料糖对大菱鲆肌肉脂肪酸的影响集中在饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸上，而对多不饱和脂肪酸的影响有限。但是，这种影响是否会导致大菱鲆对必需脂肪酸需求的改变，还有待于进一步研究。

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