RP—HPLC测定人尿液中甲磺酸帕珠沙星的浓度

徐文泉　赵勤　何思润　董奇星　秦群

[摘要] 目的 建立测定甲磺酸帕珠沙星的尿药浓度的方法，计算累积尿药排泄率。 方法 采用反相高效液相色谱（RP-HPLC）法，色谱柱为C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），柱温35℃；流动相：乙腈-甲醇-水（6∶12∶82，含0.01%磷酸和0.01%三乙胺）；流速：1.10 ml/min；检测波长：245 nm。 结果 甲磺酸帕珠沙星最低定量浓度为13.6 μg/ml；尿药标准曲线线性范围为13.6～2720 μg/ml（r=0.9997），方法回收率>90%；日内、日间精密度（RSD）<10.0%。30名健康志愿者进行单剂量静脉注射低、中、高三种剂量的注射用甲磺酸帕珠沙星后，帕珠沙星在24 h内尿液中的累积尿药排泄率分别为（92.63±5.04）%、（91.21±2.09）%、（90.22±3.53）%。 结论 该方法快速﹑简便﹑准确度高，专属性好，无杂质干扰，适用于帕珠沙星体内药物浓度的测定及药代动力学研究。

[关键词] 甲磺酸帕珠沙星；反相高效液相色谱法；尿药浓度

[中图分类号] R96 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）03（b）-0009-03

甲磺酸帕珠沙星是由日本富山公司开发的新一代喹诺酮类抗生素[1]。它通过抑制DNA促旋酶和拓扑异构酶Ⅳ来发挥抗菌作用。体内抗菌研究表明，本品抗菌谱与环丙沙星，亚胺培南相同，比头孢他定和庆大霉素广，革兰氏阳性、革兰氏阴性及厌氧菌对帕珠沙星十分敏感[2-4]。目前，国外已有对甲磺酸帕珠沙星的体内药代动力学的研究[5-6]，但较少。国内也有甲磺酸帕珠沙星药代动力学的研究[7-11]，且通过高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）测定血药浓度的研究较多[7-15]，而通过测定尿药浓度计算累积尿药排泄率的研究较少[7-8，16]，为此本研究建立了反相高效液相色谱（reversed phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）法测定尿液中甲磺酸帕珠沙星的浓度的方法，研究30名健康志愿者的尿药浓度及其累积尿药排泄率，为临床用药提供依据。

1 试药与仪器

1.1 试药

甲磺酸帕珠沙星注射液（规格：300 mg/瓶，批号：040430，含量为标示量的98.8%，清华紫光古汉生物药品有限公司）；甲磺酸帕珠沙星注射液对照品（清华紫光古汉生物药品有限公司）；左氧氟沙星（内标物，中国药品生物制品检定所）；甲醇（批号20040906，色谱纯，湖南化工研究院精细化工研究院）；乙腈（批号52334，CALEDON公司）。

1.2 仪器

美国Agilent 1100 HPLC-UV配备G1313A自动进样器和G1315B二极管阵列紫外检测器。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Agilent ZORBAX Eclipse-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），柱温：35℃；流动相：乙腈-甲醇-水（6∶12∶82，含0.01%磷酸和0.01%三乙胺）；流速1.10 ml/min；检测波长为：245 nm；进样量：10 μl。

2.2 对照品溶液及内标溶液的配制

精密称取甲磺酸帕珠沙星对照品适量，分别用甲醇定容为6.8 mg/ml的储备液，4℃储存，使用时稀释至所需浓度。

精密称取左氧氟沙星适量，用甲醇配制成3 mg/ml的内标溶液，4℃冷藏，临用时稀释至适宜浓度。

2.3 含药尿液样品的处理

吸取尿样于1.5 ml塑料离心管中，高速离心5 min，吸取50 μl尿样于1.5 ml试管中，加内标（3 mg/ml左氧氟沙星甲醇液）15 μl，加入450 μl流动相，漩涡振荡2 min，取上清液10 μl进样分析。

2.4 专属性考察

在上述色谱条件下，按上述方法操作，比较空白尿液、内标左氧氟沙星加甲磺酸帕珠沙星标准品、空白尿样加内标左氧氟沙星加甲磺酸帕珠沙星对照品以及志愿者尿样的样本色谱图，考察方法的转一性，结果如图1。

2.5 标准曲线和最低定量浓度

准确吸取空白尿样50 μl于试管中加入内标左氧氟沙星（3 mg/ml）15 μl，及帕珠沙星对照品溶液，配成含帕珠沙星为13.6、27.2、54.4、136、272、544、1360、2720 μg/ml的一系列浓度，按样品处理项下操作。以浓度C对峰面积比值进行线形回归，用最小二乘法计算得甲磺酸帕珠沙星回归方程为：A=5.046C+0.008（r=0.9997）。本方法甲磺酸帕珠沙星最低定量浓度为13.6 μg/ml。

2.6 精密度及回收率试验

空白尿液分别加入帕珠沙星标准品溶液适量，使成含帕珠沙星分别为13.6、136、2720 μg/ml低﹑中﹑高3个浓度的尿样，按样品处理项下操作，各浓度日内重复5次，连续测定5 d，计算方法回收率及日内、日间精密度（表1）。

2.7 准确度

准确吸取空白尿样50 μl于试管中加入内标左氧氟沙星（3 mg/ml）15 μl及帕珠沙星对照品溶液，使成含帕珠沙星分别为13.6、136、2720 μg/ml低﹑中﹑高3个浓度的尿样，按样品处理项下操作。连续制备并测定5 d，每个浓度进行5个样本的分析，测得浓度与真实浓度相比，计算准确度（表2）。

2.8 样品稳定性

将含药尿液样品置-40℃冰箱冷冻保存，30天后测定含量，浓度分别为13.6、136、2720 μg/ml的低、中、高三种浓度的样品含量下降变化均在3%以内（分别为原浓度的98.12%、99.32%、98.56%），说明帕珠沙星的尿样在-40℃至少30 d内保持稳定。

2.9 累积尿药排泄率

对试验期间所收集的30名健康者的尿液测定后，按公式Fc=Xu/Xo×100%（其中Xu为0～24 h的累积排药量，Xo为给药剂量，低、中、高3组给药剂量分别为150、300、600 mg）分别计算低、中、高3种剂量24 h累积排泄率，分别得到低、中、高3组24 h甲磺酸帕珠沙星的累积尿药排泄率分别为（92.63±5.04）%、（91.21±2.09）%、（90.22±3.53）%。

3 讨论

本实验采取将尿样稀释后直接进样的方法，尿样中的杂质可能会有干扰，且解冻后，部分尿样中有沉淀，为了防止沉淀堵塞色谱柱，在稀释前将尿样高速离心5 min，将上面澄清溶液转移至1.5 ml离心管中供用。在测定尿样过程中，部分尿样有杂质干扰，通过减慢流速到1.10 ml/min，杂质峰和帕珠沙星峰完全分离，不影响测定。

在选定的色谱条件下，空白尿样无内源性杂质干扰。帕珠沙星及左氧氟沙星的色谱峰形良好，杂质峰无干扰。保留时间分别为5.24 min（帕珠沙星），6.71 min（左氧氟沙星），本法具有较高专属性。

由本文研究得低、中、高3组浓度的帕珠沙星累积尿药排泄率与国内的研究报道一致，因此帕珠沙星主要经肾脏由尿液排除，并且在体内无蓄积。

HPLC-UV法测定帕珠沙星的尿样浓度，方法快速﹑简便﹑分离度好，无杂质干扰。

[参考文献]

[1] Misuyama J，Miyazaki S，Ishii Y，et al.Antibacterial activity of a new injectable quinolone pazufloxacin in vitro and in vivo[J].Jpn J Chemother，1999，47（Suppl 1）：1-15.

[2] Mitsuyama J，Takahata M，Yamashiro Y，et al.Antibacterial activity of a new injectable quinolone，pazufloxacin mesilate （PZFX mesilate），in vitro and in vivo[J].Jpn J Chemother，1999，47（Suppl 1）：37-64.

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[4] Mikamo H，Sato Y，Hayasaki Y，et al.In vitro activities of pazufloxacin，an injectable new quinolone，against bacteria causing infections in obstertric and gynecological patients[J].Jpn J Chemother，1999，47（Suppl 1）：16-38.

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[9] 王宪刚，苗佳，梁德荣，等.甲磺酸帕珠沙星注射液临床药代动力学/药效学研究[J].四川大学学报（医学版），2009，40（4）：689-693.

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[12] 吴江，徐媛，袁玉.高效液相色谱法测定人血浆中甲磺酸帕珠沙星浓度[J].江苏药学与临床药学研究，2004，12（6）：17-19.

[13] 蒋心惠，范琦，张丹，等.人血清中甲磺酸帕珠沙星的RP-HPLC测定方法研究[J].中国抗生素杂志，2006，31（7）：417-419.

[14] 刘蕾，李可欣，李扬，等.高效液相色谱法测定人血清中帕珠沙星的浓度[J].药物分析杂志，2004，24（5）：529-531.

[15] 陈勇川，石英，何菊英，等.反相高效液相色谱法测定人血浆及尿液中甲环酸帕珠沙星浓度[J]，中国药房杂志，2006，17（9）： 677-679.

[16] 蒋心惠，范琦，邓晴源，等.RP-HPLC测定人尿液中的甲磺酸帕珠沙星[J].华西药学杂志，2006，21（4）：375-376.

（收稿日期：2014-02-12 本文编辑：郭静娟）

2.9 累积尿药排泄率

对试验期间所收集的30名健康者的尿液测定后，按公式Fc=Xu/Xo×100%（其中Xu为0～24 h的累积排药量，Xo为给药剂量，低、中、高3组给药剂量分别为150、300、600 mg）分别计算低、中、高3种剂量24 h累积排泄率，分别得到低、中、高3组24 h甲磺酸帕珠沙星的累积尿药排泄率分别为（92.63±5.04）%、（91.21±2.09）%、（90.22±3.53）%。

3 讨论

本实验采取将尿样稀释后直接进样的方法，尿样中的杂质可能会有干扰，且解冻后，部分尿样中有沉淀，为了防止沉淀堵塞色谱柱，在稀释前将尿样高速离心5 min，将上面澄清溶液转移至1.5 ml离心管中供用。在测定尿样过程中，部分尿样有杂质干扰，通过减慢流速到1.10 ml/min，杂质峰和帕珠沙星峰完全分离，不影响测定。

在选定的色谱条件下，空白尿样无内源性杂质干扰。帕珠沙星及左氧氟沙星的色谱峰形良好，杂质峰无干扰。保留时间分别为5.24 min（帕珠沙星），6.71 min（左氧氟沙星），本法具有较高专属性。

由本文研究得低、中、高3组浓度的帕珠沙星累积尿药排泄率与国内的研究报道一致，因此帕珠沙星主要经肾脏由尿液排除，并且在体内无蓄积。

HPLC-UV法测定帕珠沙星的尿样浓度，方法快速﹑简便﹑分离度好，无杂质干扰。

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[16] 蒋心惠，范琦，邓晴源，等.RP-HPLC测定人尿液中的甲磺酸帕珠沙星[J].华西药学杂志，2006，21（4）：375-376.

（收稿日期：2014-02-12 本文编辑：郭静娟）

2.9 累积尿药排泄率

对试验期间所收集的30名健康者的尿液测定后，按公式Fc=Xu/Xo×100%（其中Xu为0～24 h的累积排药量，Xo为给药剂量，低、中、高3组给药剂量分别为150、300、600 mg）分别计算低、中、高3种剂量24 h累积排泄率，分别得到低、中、高3组24 h甲磺酸帕珠沙星的累积尿药排泄率分别为（92.63±5.04）%、（91.21±2.09）%、（90.22±3.53）%。

3 讨论

本实验采取将尿样稀释后直接进样的方法，尿样中的杂质可能会有干扰，且解冻后，部分尿样中有沉淀，为了防止沉淀堵塞色谱柱，在稀释前将尿样高速离心5 min，将上面澄清溶液转移至1.5 ml离心管中供用。在测定尿样过程中，部分尿样有杂质干扰，通过减慢流速到1.10 ml/min，杂质峰和帕珠沙星峰完全分离，不影响测定。

在选定的色谱条件下，空白尿样无内源性杂质干扰。帕珠沙星及左氧氟沙星的色谱峰形良好，杂质峰无干扰。保留时间分别为5.24 min（帕珠沙星），6.71 min（左氧氟沙星），本法具有较高专属性。

由本文研究得低、中、高3组浓度的帕珠沙星累积尿药排泄率与国内的研究报道一致，因此帕珠沙星主要经肾脏由尿液排除，并且在体内无蓄积。

HPLC-UV法测定帕珠沙星的尿样浓度，方法快速﹑简便﹑分离度好，无杂质干扰。

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[9] 王宪刚，苗佳，梁德荣，等.甲磺酸帕珠沙星注射液临床药代动力学/药效学研究[J].四川大学学报（医学版），2009，40（4）：689-693.

[10] 张华峰，张福成，王健康，等.甲磺酸帕珠沙星注射液在人体内的药代动力学研究[J].解放军药学学报，2009， 25（5）：417-421.

[11] 王志朝，刘祖雄，丁启瑞，等.帕珠沙星的药代动力学与临床应用新进展[J].中国药业，2009，18（2）：61-62.

[12] 吴江，徐媛，袁玉.高效液相色谱法测定人血浆中甲磺酸帕珠沙星浓度[J].江苏药学与临床药学研究，2004，12（6）：17-19.

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[14] 刘蕾，李可欣，李扬，等.高效液相色谱法测定人血清中帕珠沙星的浓度[J].药物分析杂志，2004，24（5）：529-531.

[15] 陈勇川，石英，何菊英，等.反相高效液相色谱法测定人血浆及尿液中甲环酸帕珠沙星浓度[J]，中国药房杂志，2006，17（9）： 677-679.

[16] 蒋心惠，范琦，邓晴源，等.RP-HPLC测定人尿液中的甲磺酸帕珠沙星[J].华西药学杂志，2006，21（4）：375-376.

（收稿日期：2014-02-12 本文编辑：郭静娟）