有机废弃物好氧堆肥系统中氨氧化微生物的研究进展

杜雪晴，廖新俤，2＊，吴银宝，2，陈 伟

（1.华南农业大学动物科学学院，广东广州510642；2.华南农业大学农业部生态农业重点开放实验室，广东广州510642）

好氧堆肥是一种对有机物废弃物进行资源化、无害化和稳定化处理的经济高效的方法［1］，目前已在农业固体有机废弃物如农作物秸秆、养殖畜禽粪便、病死动物尸体等，以及城市生活垃圾如餐厨垃圾、城市污泥等的处理中得到广泛应用。但好氧堆肥过程会造成不同程度的氮素损失［2－3］，一般氮素损失量约为初始总氮的16%～76%［4］，其损失途径包括氨气挥发、氧化亚氮和氮气排放、淋溶等形式，其中以氨气挥发形式损失的氮素可达氮素总损失量的44%～99%［3］，特别是在含氮较高的畜禽粪便堆肥中损失更严重。氮素损失不仅降低了堆肥的农用价值，而且会对环境产生二次污染，产生臭气和温室气体的排放、酸雨、土壤富营养化等环境问题。

研究有机废弃物堆肥过程中的氮素转化机制及相关微生物，有助于减少好氧堆肥过程中的氮素损失及温室气体排放。近年来，关于自然界氮素循环的研究取得了重要的进展，氮循环主要包括固氮作用、硝化作用、反硝化作用和氨化作用4个过程［5］，堆肥过程中含氮有机物易于被微生物分解转化为铵态氮（NH4＋），铵态氮被氧化为亚硝态氮（NO2－ ），再进一步氧化为硝态氮（NO3－ ）完成硝化作用［6］。Matsuno等［7］分析76个土壤样品的氮素循环，都观察到NH4＋的聚集，但NH4＋→NO2－ 比NO2－ →NO3－要缓慢，是由于亚硝态氮极不稳定，易被氧化为硝态氮，因此氨氧化是硝化作用的关键限速步骤［8］。自100多年前，细菌氨氧化作用被首次发现以来［9］，与氨氧化相关的微生物学研究在氮素的生物地球化学循环中一直倍受关注。长期以来，变形菌纲的氨氧化细菌（Ammonia Oxidizing Bacteria，AOB）被研究者普遍认为是地球氮素循环过程中最主要的承担者［10］，然而随着环境微生物分子生态学技术的发展和研究的深入，国内外众多研究者发现了另一类完全独立于AOB 的具有氨氧化能力的微生物－氨氧化古菌（Ammonia Oxidizing Archaea，AOA）［6］，在氮循环中可能起着非常重要的作用［5，11］。至此，再次引起人们对氨氧化微生物的广泛关注和研究。如前所述，在堆肥系统中，氨氧化作用对氮素的转化非常重要，直接影响到堆肥的农用价值及堆肥过程中氨气和氧化亚氮的排放。因此本文介绍了好氧堆肥系统中的两种主要氨氧化微生物AOB和AOA 的生理生态特性及其影响因素，总结了堆肥过程中氨氧化微生物对氮素转换的作用和可能的调控措施，以期为今后氨氧化微生物在堆肥系统中的应用提供参考。

1 好氧堆肥系统中氨氧化微生物的种类及特性

目前，自然界中发现的氨氧化微生物主要有好氧氨氧化细菌（AOB）、氨氧化古菌（AOA）和厌氧氨氧化细菌（anaerobic ammonium oxidation，Anammox）。其中AOA 和AOB都能将氨氧化为亚硝酸盐，它们广泛分布在海洋、土壤和湿地等生态系统中［12－15］；Anammox属于浮霉菌门，是污水处理中非常重要的细菌，可以在缺氧环境中，将铵离子（NH4＋）用亚硝酸根（NO2－）氧化为氮气，其化学方程式为NH4＋＋NO2－ →N2＋2H2O，Δ Go ＝－357kJ mol－1［16－17］。这三种细菌对全球氮循环具有非常重要意义，目前对好氧堆肥系统中氨氧化微生物的研究主要集中在AOA 和AOB。

1.1 好氧氨氧化细菌（AOB）

好氧氨氧化细菌（AOB）属于变形菌门，是一类能够在好氧条件下将氨氧化为亚硝酸盐的化能无机自养型细菌，其含有一种可催化铵氧化为羟胺的胞内酶即氨单加氧酶（ammonia monooxygenase，amoA），由amoA、amoB和amoC 3个亚基组成［18］，amoA 基因在氨氧化菌中普遍存在且可作为氨氧化菌特异的分子标记［19－20］。通过16SrRNA 基因序列同源性的系统发育分析发现环境中的好氧氨氧化菌主要属于β－和γ－Proteobacteria 两个亚纲，其中γ－Proteobacteria亚纲适合在海洋环境中生长［21］，β－Proteobacteria亚纲则适合在淡水环境中生长，可分为亚硝化单胞菌属（Nitrosomonas）和亚硝化螺菌属（Nitrosopira）［16］。

Maeda等［22］2010年在牛粪堆肥的表面检测到大量的amoA基因，同年Yamamoto等［23］在牛粪堆肥的研究中发现AOB的优势种群主要为亚硝化单胞菌属，孙志远［24］和虞泳等［25］分别在牛粪堆肥和秸秆等农业废物好氧堆肥研究中都发现Nitrosospira和Nitrosomonas 为AOB 优势种属，其中Nitrosomonas存在于整个堆肥过程中，是耐受性较强的种属，在堆肥体系氨氮的氧化过程中可能发挥着重要的作用。2012年，Yamamoto等［26］在猪粪堆肥也中检测到与亚硝化单胞菌属基因序列相似性较高的AOB，且AOB非常活跃的参与了堆肥过程的硝化作用，说明AOB对堆肥过程的硝化作用至关重要。而贺纪正等［27］在长期施用氮磷钾肥和有机质肥的土壤生态系统中检测到的AOB主要为亚硝化螺菌属（Nitrosopira），说明在不同陆地生态系统中AOB的种群分布存在差异。

1.2 氨氧化古菌（AOA）

自Venter等［28］2004年在在海水微生物宏基因组测序中首次发现泉古菌拥有与硝化细菌非常类似的amoA基因，提出海洋泉古菌可能具有氨氧化能力以来，激起了广大学者对不同生态环境中泉古菌氨氧化能力的广泛关注。2005年，Treusch等［29］在对土壤泉古菌基因组分析时也发现泉古菌拥有amoA基因，同年，Konneke等［6］成功分离并获得一株具有氨氧化能力的中温泉古菌Nitrosopum ilusmaritimus纯培养物，继而Francis等［30］将具有氨氧化能力的泉古菌命名为氨氧化古菌（ammonia－oxidizing archaea，AOA）。

氨氧化古菌属于泉古门菌，含有氨单加氧酶的全部亚基［29］，是一类完全独立于AOB 的进化类群。它能将铵态氮氧化为亚硝态氮同时固定二氧化碳，进行无机自养，而且它可以耐受缺氧环境，是深海海域等缺氧环境中氨氧化的优势微生物类群［31］。根据amoA基因序列变异及其所栖息的生态环境，可将硝化古菌分为海洋环境硝化古菌群落、土壤环境硝化古菌群落、嗜高温环境硝化古菌群落3 大类［32］。

最近的研究发现在土壤［33－34］和海洋［5，13］生态系统中AOA 的amoA 丰富度通常远高于AOB 的amoA，Gannes等［35］在热带地区堆肥系统的研究中也证实了该结论。然而也有研究发现在微好氧条件下的海湾底泥中AOB 数量高于AOA［36］。2012年Yamamoto等［26］通过实时荧光定量PCR，在牛粪、鸡粪、猪粪三种粪便堆肥过程中检测到AOB 数量明显高于AOA，表明在动物粪便堆肥过程中，AOB可能比AOA 分布更广泛。由此可见，AOA 广泛存在于不同生态系统中，对自然界中氨的氧化具有重要作用，但不同生态系统中AOA 和AOB的分布存在差异。

此外，Yamamoto等［37］利用16srRNA 序列进行同源性分析发现在牛粪堆肥过程中分离出的AOA 与猪粪、鸡粪堆肥过程分离的Candidatus Nitrososphaera相似性高达99%，PCR－DGGE 表明牛粪堆肥过程中的AOA 明显多于猪粪和鸡粪堆肥，但Yamada等［38］2013年在铵含量较高的牛粪堆肥过程中却未能检测到AOA。

解开治等［39］在鸡粪好氧堆肥中发现总氮、亚硝态氮和硝态氮对AOA 群落结构的演替影响显著。

尽管环境中存在大量的AOA，但由于其在实验室条件下难培养，目前只有少数AOA 菌群被鉴定出来，因此其生理生态学特性还有待进一步研究。

2 堆肥过程理化指标对氨氧化微生物群落结构的影响

堆肥过程一般分为升温阶段、高温阶段、降温阶段和腐熟阶段4个阶段［40］，每一阶段堆肥的温度、铵浓度、pH 等理化指标都存在显著差异，而堆肥中微生物的组成和群落结构与这些理化指标密切相关。孙志远［24］在牛粪堆肥过程中对氨氧化细菌数量与牛粪堆肥理化参数分析表明，堆体温度、氨态氮和硝态氮对氨氧化细菌数量有着显著影响；虞泳等［25］在秸秆等农业废物好氧堆肥中基于手动选择的RDA 分析结果也表明，堆体温度、NH4＋－N 和NO3－－N 对AOB群落演替有着显著的影响（P＜0.05），且前两个因子达到了极显著水平（P＜0.01）。可见，有机废弃物堆肥过程中堆体物料理化性质的改变会影响AOA 和AOB 的种类和群落结构，这些参数的有效控制对有机废弃物好氧堆肥过程中氨氧化微生物活性的调控具有重要的意义。

2.1 温度

温度是影响微生物生长和生存的最主要的环境因素之一［41］，对堆肥体系中氨氧化微生物种群结构产生重要影响。Yamamoto［26］研究发现，在牛粪堆肥中AOB 的群落结构发生了明显变化，在高温阶段（＞60 ℃），Nitrosomonas europaea cluster为优势菌群，在温度降低时则出现了Nitrosomonas spp.Cluster；AOA 菌群则在温度降低时开始出现，且AOA 的amoA 基因数为3.2～3.9×107，明显高于AOB的amoA 基因数2.2～3.2×106；通过16s rRNA 序列进行同源性分析发现，牛粪堆肥中AOA的基因序列与土壤及沉淀物中的AOA 相似。

在稻草秸秆和蔬菜叶混合的农业固体废弃物堆肥中［42］，全程都能检测到AOA 的amoA 基因，且AOA 在高温和降温阶段占主导地位；AOB 的amoA 基因则在高温和降温阶段下降到不能检出。此外，AOA 和AOB的amoA 基因丰富度与潜在的氨氧化作用都存在线性相关性，AOB在中温和腐熟阶段与氨氧化作用存在显著线性相关，说明在堆肥过程中AOA 和AOB 都非常活跃的参与了堆肥过程的硝化作用。虞泳在秸秆等农业废物好氧堆肥中发现AOB 群落的Shannon－Weaver指数初始值为2.58，堆肥结束时为2.02，多样性整体呈下降趋势，通过对部分优势条带进行克隆测序，AOB群落结构在堆肥高温期前期（4～9d）变化较小，而在高温期后期（9～12d）特别是降温期（12～25d）演替尤为剧烈［25］。由此可见堆肥过程中温度对AOA 和AOB的群落组成和动态变化有很大影响，但在不同堆肥系统中高温和低温阶段AOA 和AOB 的群落组成存在差异，这可能与不同堆肥系统中铵离子浓度、pH、C／N 等有差异有关。

2.2 铵离子浓度

铵作为氨氧化微生物的间接底物，其浓度与氨氧化微生物的数量和种类有直接关系［43］，Burrell［44］的研究表明，不同铵离子浓度的氨氧化菌富集培养物样品中检测出不同的氨氧化菌种属，且在牛粪［24］、秸秆［45］等农业废弃物好痒堆肥的研究都表明在有机废弃物好氧堆肥中氨氮对AOB 群落结构的演替达到显著水平。

有研究发现高浓度铵态氮具有抑制嗜温硝化古菌同化CO2的能力，说明高浓度铵态氮可能抑制氨氧化能力［46］。Yamada［38］在铵态氮含量较高的牛粪堆肥中的各个阶段都检测不到AOA，但在中温阶段能检测到丰富的AOB；孙志远［24］在牛粪堆肥中同样也证实了AOA 的存在，不过只在堆肥后期发现有该菌的存在，这种现象可能是堆肥其它时期中铵态氮的含量较高造成的，所获得的AOA amoA 基因序列都属于泉古菌门（Crenarcharota），AOA 群落结构比较单一；Di等［47］研究AOA 和AOB 在不同土壤氮条件下的生长情况时发现AOB 可以在高铵离子浓度的土壤中生长，而AOA 适于在较低铵离子浓度的土壤中生长，说明AOB 对铵离子浓度的适应范围较AOA 的适应范围广。

此外，在处理猪废水的湿地中，AOB 的数量与NH4＋和NO3－ 的浓度具有很高的相关性［48］，在高钙草原土壤中铵态氮浓度的升高会显著促进AOA的amoA 基因表达量［29］，稻田土壤中氮肥的施用也会显著促进AOA 的生长和表达活性［49］，但也有研究发现在长期施用氮肥的碱性砂质土壤或高氮草原土壤中，AOA 的丰富度和活性并没有随铵态氮浓度的升高而增加，而AOB的数量和活性不仅与土壤硝化活性正相关，而且随土壤铵态氮浓度的升高而升高［50］。说明铵态氮浓度会影响到土壤生态系统中AOA和AOB的群落结构和活性，且铵态氮浓度较高的生态系统中AOB对硝化作用的贡献可能更大。

大量研究表明在牛粪堆肥过程中能同时检测到AOA 和AOB［23，26，38］，为研究它们的生物学特性，Oishi进行了液态牛粪堆肥发酵试验［51］，在不同温度（37 ℃、46 ℃、60 ℃）和不同氨浓度（0.5、1、4和10mM NH4＋－N）下观测它们的生长情况，利用实时聚合酶链反应测定AOB和AOA 的生长速率，研究发现AOB的最适生长环境为37 ℃，4或10mM NH4＋－N，通过DGGE 和测序分析发现优势菌群为Nitrosomonas halophila；而AOA 的最适生长环境为46 ℃，10 mM NH4＋－N，优势菌群主要为Candidatus Nitrososphaera gargensis。此研究首次证明AOA 中的优势菌能在牛粪堆肥过程中的适度高温下氧化NH3进行生长。

2.3 pH

有机废弃物的堆肥初期pH 变化较明显，一般认为pH 在7.5～8.5时，可获得最大堆肥效率，由于堆肥过程中微生物的群落结构变化是多因素影响的结果，因此目前较少单纯研究堆肥过程pH 对AOA 和AOB的影响，一般结合铵态氮、硝态氮等理化指标研究。

不过大量研究发现在土壤生态系统中pH 对AOA 和AOB的群落组成存在影响，虽在不同pH条件下都能检测到AOA［27，33，52－53］和AOB［54－55］，但其氨氧化能力可能存在差异。Nicol等［52］在不同土壤pH 对AOA 和AOB 丰富度、多样性、转录活性的研究中发现，土壤pH 在4.9～7.5的范围内，发现古菌的amoA 基因丰富度会随着pH 的升高而降低，而细菌的amoA 基因丰富度一直很低，但会随着pH 的升高而升高。此外不同pH 下，AOA 和AOB的种群也发生了变化，这种变化会影响酸性土壤的硝化作用。

2.4 其它因素

有研究表明在污泥和土壤中，有机质可抑制硝化作用［56－57］，也有研究发现在污水处理器中有机质可降低硝化速率，影响AOB 的群落结构［58－59］。Yang等［30］在家庭垃圾堆肥的中温阶段加入有机质，发现添加组的NO2－和NO3－比对照组低102～103倍，从N 素平衡的角度发现有机质的降解对氨氧化有负面影响，氨氧化细菌减少，可能是异养型微生物与氨氧化微生物竞争O2的原因，但AOB的生长需要有机质的支撑，所以这些影响机制需进一步讨论和研究。此外，有研究发现海水和淡水中的AOB存在差异［61－62］，说明盐度对氨氧化细菌的生长和生理特性也存在一定影响。

3 堆肥系统中AOA 和AOB 对氮素转换的作用及调控

有机废弃物堆肥过程中以氨气形式损失的氮素所占比例有所不同，它与堆肥过程中的温度、pH、含水率、C／N 比等多种理化性质密切相关。研究表明，堆肥过程中的铵态氮可使堆肥物料pH 升高并且易以NH3的形式挥发，特别是在高温阶段或pH较高时［63－64］。目前虽然可以通过调节pH、改变通风或翻堆频率、添加吸附剂等方式来调控堆肥过程中氮素的转化，但仍然存在很多问题，因此很多研究者希望通过调节堆肥过程中与氮素转化相关的微生物来提高堆肥过程中氮素的保留继而增加肥效，减少环境污染。

在农业废弃物堆肥全过程中，AOA 和AOB 的amoA 基因丰富度与潜在的氨氧化作用都存在线性相关［42］。在粘土土壤和市政垃圾堆肥中，与氨氧化作用相关的微生物的群落和丰富度可以作为土壤硝化能力的指标［65］，说明氨氧化微生物对有机废弃物堆肥过程中硝化作用贡献很大。已有研究表明在牛粪堆肥过程中经过翻堆处理的堆肥样品中AOB 种类、数量明显多于不翻堆处理的堆肥样品［24］，在堆肥过程中若可以通过改变工艺参数等方法调控AOA 和AOB的群落结构，将提高硝化速率，减少氮素的损失。

喻其林［66］在鸡粪好氧堆肥中筛选出两株高效氨氧化霉菌M25～22（Penicillium sp.）与M40～4（Aspergillus sp.），其最适蔗糖浓度分别为12g／L、10g／L，碳源浓度明显低于通常的霉菌培养基（如查氏培养基）；最适铵态氮浓度分别为2.438mg／mL、2.014mg／mL，氮源浓度明显高于通常的霉菌培养基。可见与菌体生长相比，氨氧化需较低C／N，这与氨氧化本身的作用特点，即低碳源环境为氨氧化作用提供驱动力，以及铵态氮是氨氧化的作用底物有关。将其应用到堆肥中，两种菌剂均能促进堆肥中铵态氮及有机氮向硝态氮的转化，降低堆肥氮素损失；且两菌剂组中温度、含水量、pH、C／N 等理化指标的变化均有利于堆肥腐熟化的进行，有机质的含量与对照相比偏低，而种子发芽指数与对照相比偏高，说明两者回归堆肥后，均能促进堆肥腐熟。

由于实验室内采用传统的细菌分离培养技术都不易获得AOA 和AOB，所以通过向堆肥中添加发酵培养液增加AOA 的种类和数量以降低氮素损失的研究是一个非常值得探讨研究方向。解开治等［67］通过向家禽粪便堆肥过程添加在污泥中扩培养的AOA 接种液（1.0×109CFU／mL），发现能加快高温阶段进程，缩短堆肥腐熟的时间，在堆肥初始阶段能显著促进硝化作用，在低温阶段pH 比对照组低，有助于氮的保存。试验组氨气挥发量和氧化亚氮的排放量分别为对照组的14.7%和4.2%，说明通过添加AOA 可以降低氮以气体的形式损失。通过添加AOA 能显著增加堆肥初期氨氧化古菌的菌落种类和数量，但其机制尚需继续研究。

迄今为止，异养氨氧化的报道不多，对其氨氧化的特性也有待进一步研究。为寻找适用于堆肥的嗜热异养氨氧化细菌，巴顿等［68］采用稀释涂布平板法和格里斯试剂显色法筛选嗜热异养氨氧化细菌，从大理洱源热泉中分离出两株嗜热异养氨氧化细菌，菌株NC8和NJ26，分别为Bacillus属的不同种，其最适生长温度为55 ℃，最适生长pH 为8.0；在最适生长条件下，NC8和NJ26菌株对NH4＋的最大单位体积减少率分别为1033.3mg／L和1183.67mg／L；对NO2－和NO3－ 最大单位体积产生率分别为23.79 mg／L、272.30 mg／L 和33.81 mg／L、366.70 mg／L。研究表明，NC8和NJ26能将NH4＋氧化成NO2－ 和NO3－，以NO3－为主要积累产物。目前NC8和NJ26还未用于堆肥实验，有望应用于堆肥过程中以减少氨气排放，同时提高堆肥中氮素的含量。

4 研究展望

目前，通过分子生物学、宏基因组学、培养及非培养等方法的结合，氨氧化微生物的研究在诸多方面已取得重要进展。但仍然存在诸多问题需要深入地研究和探讨，特别是在堆肥系统中的氮素减排的研究：如利用现代分子生物学手段检测不同堆肥系统中氨氧化微生物的优势菌群；并进一步深入研究在不同堆肥系统和堆肥不同阶段中的氨氧化微生物的群落结构变化，以及pH、铵态氮浓度、氧气等理化性质对氨氧化微生物的影响，及其与其它微生物群落的互作关系。此外，氨的挥发主要在堆肥高温阶段，是否能分离、筛选不同生态环境中的耐高温的氨氧化微生物或直接从堆肥系统中提取扩增优势菌群以减少氮素损失？研究堆肥过程中氨氧化机制与反硝化机制的联系，是否在增强氨氧化微生物硝化作用的同时也减少了N2O 的排放，从而增加了氮素的保留和堆肥肥效？这些问题都需要利用现代分子生物学方法进一步研究解决，以增强氨氧化微生物在堆肥系统和其它氮素循环相关领域的利用。

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