超声辅助复乳法制备多孔海藻酸钠/羟基磷灰石复合微球的研究

聂 晶，李湘南，刘小平

（武汉理工大学化学化工与生命科学学院，武汉 430070）

羟基磷灰石（HAP）由于具有的生物相容性和骨传导生物活性在骨修复医学领域广泛应用，但是HAP是纯无机生物陶瓷材料，脆性大，不易加工成型，形状不规则的HAP颗粒植入人体会影响周围组织的愈合，压迫神经引发疼痛，引发炎症反应等［1］；在单独作为骨填充材料时，羟基磷灰石颗粒由于粘附性差成形困难会出现颗粒移动，易外溢，导致脱落［2－4］。为解决这些问题，最好的方法就是将HAP与有机高分子材料进行复合，构筑具有一定形状、结构和功能的无机－有机复合材料［5］。目前研究最多的与HAP复合的高分子包括聚乳酸、明胶、海藻酸钠（SA）、壳聚糖等［6］。高分子生物材料－纳米羟基磷灰石复合微球能够综合高分子的生物特性、纳米羟基磷灰石的各项性能以及微球类材料填充性好、比表面积高、流动性好，易于注射等优良特性，在骨组织修复材料研究中有着重要的意义［7－10］。

以纳米HAP粒子为核心的复合微球具有大的比表面积，吸附和承载药物能力强，内部存在大量微米和纳米级尺寸的孔道，为药物释放提供了大量的通道，使被载药物可以连续而缓慢地释放；同时，纳米HAP粒子包埋于凝胶网络结构中，可以增加凝胶的机械强度［11，12］。本课题研究试图本研究拟采用超声辅助复乳法原位制备SA/HAP复合球［13，14］，SA的引入可以解决多孔HAP微球粘附性差、韧性差的缺点；同时纳米HAP粒子包埋于SA凝胶网络结构中，可以增加微球的机械强度。

1 实 验

1.1 药品

药品：

四水硝酸钙Ca（NO3）2·4H2O 天津市博迪化工有限公司

磷酸氢二铵（NH4）2HPO4国药集团化学试剂有限公司

海藻酸钠（粘度范围1.05～1.15Pa·s） 天津市光复精细化工研究所

环己烷 国药集团化学试剂有限公司

span－80 天津市福晨化学试剂厂

tween－80 北京鑫洲科技有限公司

氢氧化钠 上海展云化工有限公司

无水乙醇 上海振兴化工一厂

所用药品均为分析纯，所用水均为去离子水。

1.2 仪器

FA25乳化机 巩义市予华仪器有限责任公司

DW－3型数显电动搅拌器 巩义市予华仪器有限责任公司

KQ2200－DE型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司

HH－2智能数显恒温水浴锅 巩义市予华仪器有限责任公司

LGJ－10型冷冻干燥机 北京四环科学仪器厂制造

FA2104S型电子天平 上海天平仪器厂

1.3 多孔SA/HAP微球的制备

内水相溶液：称取海藻酸钠0.2g，加入22mL去离子水，40℃左右磁力搅拌充分溶解，得到溶液1；继续称取磷酸氢二铵0.804g溶于溶液1中，用NaOH溶液调节pH至10，作为内水相溶液。

W/O初乳液：将3mL司盘80溶于50mL环己烷中，磁力搅拌充分溶解，作为油相。将内水相溶液倒入油相1 000r/min快速搅拌，同时超声10min后得到白色的W/O初乳液。

W/O/W复乳的制备：配0.5M四水硝酸钙溶液160mL作为外水相溶液；将上述W/O初乳液倒入外水相，400rpm搅拌10min后加入表面活性剂吐温80，继续搅拌形成W/O/W复乳。

在上述复乳体系中，外水相包含油相的微滴，每个油相液滴中内含一个或者几个分散隔离的内水相小囊泡，在此复乳体系中存在两个界面：外水相与油相的界面（界面2）、油相与内水相界面（界面1）。（见图1）。在实验条件下，当Ca2＋扩散到内水相，与内水相中的HPO42－发生如方程式（1）所示反应，生成HAP。

扩散到内水相的Ca2＋在参与反应生成HAP的过程中也起到了内水相中SA交联剂的作用，内水相的SA溶液在Ca2＋作用下原位发生胶凝作用，形成了稳定的凝胶核，SA凝胶核的多孔网络结构使Ca2＋在内水相内部生成HAP的反应受到抑制，HAP更多的在界面1上沉淀下来。

SA/HAP复合球的制备：制备的复乳常温搅拌24h使反应充分，反应完成后乳液分层，将有机溶剂旋转蒸干后，3 500rpm离心得到粗产物，依次用环己烷、丙酮、无水乙醇洗涤两次，冷冻干燥48h制得产品。

1.4 复合球测试表征

利用X射线衍射仪（XRD，型号：D/Max－RB，日本Rigaku公司）对产物进行X射线图谱分析，测试角度选择10°～80°；产物粉末进行KBr压片后，傅里叶红外光谱分析仪（FTIR，型号：Nexus，美国Thermo Nicolet公司）分析产物的化学组成；产物粉末喷金，进行扫描电镜（SEM，型号：JSM－5610LV，日本Jeol公司）观察；将产物用无水乙醇分散后铜网打捞，待无水乙醇挥发后进行透射电镜（TEM，型号：H－600STEM/EDX PV9100，日本HITACHI公司）观察。

2 实验结果

2.1 不同反应温度对多孔SA/HAP微球形貌的影响

配制三份0.3M磷酸氢二铵溶液，按2.4中的实验方法操作，反应温度分别保持在常温（25℃）、50℃和80℃，400rpm搅拌反应24h。得到三份产物，分别进行SEM表征，结果见图2。

从图2可以看到25℃反应温度下得到的微球表面光滑；图2（b）中可以看到50℃反应温度下得到的复合微球有两种表面形貌，一种为具有网络结构的凝胶微球，一种为表面相对光滑的微球，当温度T升高时，Ca2＋扩散速率加快，Ca2＋扩散进入内水相后，HAP的生成反应开始，同时，内水相中的SA也开始发生交联反应，粒径大的内水相中形成的凝胶将反应生成的HAP沉淀包覆于其中，在冷冻干燥条件下形成具有高孔隙率的网络结构的凝胶微球，而粒径小的内水相中生成SA凝胶颗粒较小，反应中在界面上沉淀下来的HAP颗粒将SA凝胶球表面孔隙填充紧实，形成表面光滑的复合球。

当反应温度继续升高到80℃时，从图2（c）中可以看到产物基本已经没有明显的球形粒子了，整体成团簇状结构，这是由于温度进一步的升高，导致乳液不稳定，生成HAP的反应还未完成就发生了破乳现象。

2.2 不同反应时间对多孔SA/HAP微球形貌的影响

实验中发现反应时间是另一个影响产物形貌的重要因素。将反应温度固定为25℃，由于反应温度较低，离子扩散速度较慢，反应进行的时间较长，所以反应时间分别设计为12h、24h和36h，按照1.3中的实验方法操作，得到三份产物，分别进行SEM表征，结果见图3。

从图片上可以看到不同反应时间所制备的产物形貌有很大差别，随着反应时间的延长，可以看到多孔微球的形成过程。反应12h后制得的微球由于生成的HAP壳层较薄，在后续的处理过程中基本碎裂，SEM图片上只看到很少量的球形产物存在；当反应时间延长到24h，形成的复合球在后续处理中有足够的强度保持形貌稳定。当反应时间延长到36h，HAP继续在复合球表面沉淀，明显看到复合球表面粗糙度提高，由于新增加的为HAP纳米晶粒，表面能大，所以产物之间的团聚也加剧了。

2.3 多孔SA/HA微球的成分分析

配两份0.3M磷酸氢二铵溶液，按1.3中的实验方法操作，反应温度都控制在25℃，400rpm搅拌反应24h，得到的产物1。取其中一份产物在700℃灼烧8h完全烧除有机物，冷却后得到产物2。将两种产物分别在研钵中研成细小粉末，进行XRD与IR测试分析产物的成分组成，结果如图4、图5所示。

从图4可以看到冷冻干燥的产物XRD图峰宽化，HAP特征衍射峰不明显，这与微球中HAP颗粒为纳米级，结晶度低有关。而高温煅烧后的产物XRD图谱中各衍射峰变窄而尖锐，峰强提高数倍，因为HAP的晶粒随着温度的升高在进一步发育完整，晶化程度有很大提高。与羟基磷灰石标准JCPDS卡片（卡片号25－0166）比对后，在图中标出衍射峰对应的HAP晶面，进一步说明复合球中存在HAP相。

从图5（c）中可以看到SA的特征峰：3 396cm－1处的大宽峰是—OH的伸缩振动峰，1 600～1 700cm－1处为C=O的特征峰，1 425cm－1、1 384cm－1处为（COO）－的对称伸缩振动峰；由于部分海藻酸钠分子中的COO－基团与Ca2＋交联，因此发生峰裂分，产生两个峰；同时，还可以看到900～1 200cm－1和400～650 cm－1处PO3－4离子的反对称伸缩振动和弯曲振动的特征峰；对比这些红外光谱可以看出，复合微球中同时出现了SA与HAP的特征吸收峰，说明了复合微球含有HAP和SA成分；并且相比于纯物质，在SA/HAP复合球的IR图中，这些特征峰峰强变大，峰形也发生了变化，也说明了SA中的COO－基团有一部分与Ca2＋发生了交联反应。

3 结 论

阐述了共沉淀法结合复乳法制备多孔SA/HAP微球的机理，在磷酸二氢铵内水相溶液中溶入海藻酸钠制备混合溶液作为内水相，采用W/O/W复乳法制备了SA/HAP复合微球，通过实验，探讨了反应温度和反应时间对产物形貌的影响，适宜的合成条件为：反应温度25℃，反应时间24h，在此条件下制备的产物为球形粒子。采用XRD、IR分析了产物含有SA与HAP，并且两者之间存在某种物理作用力。从SEM图片上可以看到SA/HAP复合球粒径分布在0.4～1μm之间，通过将SA/HAP复合微球进行高温煅烧，采用TEM和XRD技术来表征SA/HAP复合微球的微观结构和组成，说明了制备的SA/HAP复合球是一种多孔微球，HAP纳米粒子分布在SA网络结构中。

［1］ Fulmer M T，Ison IC，Hankermayer CR，et al.Measurements of the Solubilities and Dissolution Rates of Several Hydroxyapatites［J］.Biomaterials，2002，23（3）：751－755.

［2］ Ferraz M P，Mateus A Y，Sousa J C，et al.Nanohydroxyapatite Microspheres as Delivery System for Antibiotics：Release Kinetics，Antimicrobial Activity，and Interaction with Osteoblasts［J］.Wiley InterScience，2007，81A（4）：994－1004.

［3］ 赵 颖，徐 为，姚爱华，等.多孔羟基磷灰石微球的原位转化制备研究［J］.功能材料，2010 41（7）：1124－1126.

［4］ Mizushima Y，Ikoma T，Tanaka J，et al.Injectable Porous Hydroxyapatite Microparticles as a New Carrier for Protein and Lipophilic Drugs［J］.J Control Release，2006，10（2）：260－265.

［5］ Sun L，Sung K B，D entinger C，et al.Composite Organic－inorganic Nanoparticles as Raman Labels for Tissue Analysis［J］.Nano.Lett.，2007，7（2）：351－356.

［6］ Teng S，Shi J，Peng B，et al.The Effect of Alginate Addition on the Structure and Morphology of Hydroxyapatite/Gelatin Nanocomposites［J］.Composites Science and Technology，2006，66（11－12）：1532－1538.

［7］ Sivakumar M，Rao K P.Preparation，Characterization and in Vitro ReIease of Gentamicin from Coralline Hydroxyapatitegelatin Composite Microspheres［J］.Biomaterials，2002，23（15）：3175－3181.

［8］ Yamaguchi I，Tokuchi K，Fukuzaki H，et al.Preparation and Microstructure Analysis of Chitosan/Hydroxyapatite Nanocomposites［J］.Journal of Biomedical Materials Research Part A，2000，55（1）：20－27.

［9］ Shchukin D G，Sukhorukov G B，Mohwald H.Biomimetic Fabrication of Nanoengineered Hydroxyapatite/Polyelectrolyte Composite Shell［J］.Chem.Mater.，2003，15（20）：3947－3950.

［10］Lin H，Yeh Y J.Porous Alginate/Hydroxyapatite Composite Scaffolds for Bone tissue Engineering：Preparation，Characterization，and in Vitro Studies.Biomed Mater Res Part B：Appl Biomater，2004，71B（1）：52－65.

［11］Jevtic M，Radulovic A，Ignjatovic N，et al.Controlled Assembly of Poly（D，L－lactide－co－glycolide）/Hydroxyapatite Coreshell Nanospheres Under Ultrasonic Irradiation［J］.Acta Biomater，2009，5（1）：208－218.

［12］Yamaguchi I，Tokuchi K，Fukuzaki H，et al.Preparation and Mechanical Properties of Chitosan/Hydroxyapatite Nanocomposites［J］.Bioceramics，2000，192（1）：673－676.

［13］Kimura I，Honma T，Riman R E.Preparation of Hydroxyapatite Microspheres by Interfacial Reaction in a Multiple Emulsion［J］.J Ceram Soc Jpn，2007，115（1348）：888－893.

［14］Chen B H，Chen Kang－I，Ho Mei－ling，et al.，Synthesis of Calcium Phosphates and Porous Hydroxyapatite Beads Prepared by Emulsion Method［J］.Materials Chemistry and Physics，2009，113（1）：365－371.