PCR-DGGE应用于土壤生态学研究的流程及优化

许文欢，阮宏华

(1.南京林业大学林学院，江苏 南京 210037；2.南京林业大学，江苏省林业生态工程重点实验室，江苏 南京 210037)

PCR-DGGE应用于土壤生态学研究的流程及优化

许文欢1，阮宏华2*

(1.南京林业大学林学院，江苏 南京 210037；2.南京林业大学，江苏省林业生态工程重点实验室，
江苏 南京 210037)

土壤微生物的多样性在生态学研究中越来越受到关注。能反映微生物多样性的技术有很多，PCR-变性梯度凝胶电泳(Polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis, PCR-DGGE)技术是其中的一种。此技术有其独到特色，广泛应用于各个领域。目前关于该技术的应用已有许多报道，然而缺少对该技术应用于土壤生态学研究详细操作流程的归纳和总结。操作过程中有许多技术性问题，包括如何提取和纯化土壤DNA、PCR反应条件设置、DGGE电泳条件设置以及图谱数据分析等。该文简要归纳了PCR-DGGE技术应用于土壤生态学研究的流程以及如何优化关键性步骤，并提出了有待优化的方向。

PCR-DGGE；土壤微生物； 生态学； 流程； 优化

对于土壤生态学的研究，物质循环和物种多样性是研究的焦点问题。在土壤中，微生物种类极其丰富，参与了各种元素循环，仅仅关注非生物的物质循环或生态研究已经无法满足要求，因此土壤微生物的研究在土壤生态学中越来越受到重视。更多了解土壤微生物群落的分布、遗传多样性及其动态特征成了探索土壤微生物的必要途径。传统方法如平板分离等，局限性很多，仅有1%的环境微生物可在培养皿上培养和分离，而85%～99%细菌种群不能被分离和认识[1-2]，且无法良好地反映出土壤微生物多样性的原始特征[3]。

分子生物技术的发展，为土壤微生物多样性方面的研究提供了重要的技术支撑。分子生物学的许多方法已应用于评价土壤微生物群落多样性的变化[4]，如变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)、限制性酶切片段多态性分析(RFLP)和末端限制性酶切片段多态性分析(T-RFLP)等。其中，PCR-DGGE技术可以更好地解析微生物生态复杂性，也可以提供生态系统中微生物多样性和群落动态性信息。目前关于该技术的应用已有许多报道，本文对PCR-DGGE在土壤微生物生态学研究中的流程及优化进行归纳和分析。

1 PCR-DGGE的原理及其优缺点

1.1 基本原理

PCR-DGGE是1979年由 Fischer等最先提出用于检测DNA突变的一种电泳技术，是目前可以探知最完整环境微生物群落结构的分子生物技术。基本原理是不同微生物DNA碱基序列的差异会导致微生物DNA解链程度不一样，利用这一特性，将得到的DNA样品在含有线性梯度变性剂的凝胶中进行电泳，不同DNA片段在胶体上会产生许多不同条带。将条带进行染色后，就能在成像系统中观察到条带，每一个条带代表一个特定序列的DNA片段。每个样品在各自泳道中形成条带，在不同泳道中停留在相同位置的条带，一般可视为具有相同DNA序列，而位置差异越大，条数越多相对来说微生物种群越丰富。根据图谱和条带信息，可以得到微生物遗传多样性信息，更好地解析微生物的生态复杂性。

1.2 优缺点

与传统的琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳相比，这项技术可以分辨只有一个碱基差异的基因序列[5]。不仅电泳条件很好控制，操作简便，快速，重复性好，而且只需1～5ng的DNA或RNA加样量就可以达到很清晰的电泳效果。其最大的优势之一是可以同时分析多个样品，可以检测环境变化引起的微生物群落变化[6]。Donner等[7]利用该技术跟踪了远洋动态变化过程中细菌群落结构和活性的连续变化。

这项技术也具有其缺点和局限性，第1，土壤DNA提取过程除杂纯化很困难；第2，DGGE技术一般要求DNA长度在500 bp以下，否则DGGE的分辨率会下降。但是如果用来判断微生物所属的系统类群，16S rDNA片段长度要求至少达到500 bp[8]。第3，不同DNA序列可能发生共迁移现象，因此DGGE的条带数有可能不能正确反映被分析的混合物中不同序列的数量，有时1个条带可能代表几种菌，也可能不同条带代表1种细菌。第4，染色后DNA谱带强度有可能较弱或很不清晰。

2 PCR-DGGE的操作流程及优化

PCP-DGGE的基本操作流程包括(1)土壤微生物总DNA的提取和纯化；(2)对提取DNA的一些区段进行PCR扩增；(3)将PCR的反应产物进行DGGE分析；(4)对电泳图谱照片进行数据分析。

2.1 土壤DNA的提取和纯化优化

从土壤中提取和纯化DNA是最关键的技术问题之一，因为土壤中含有很多复杂难以去除的成分，如多酚类物质等。

土壤中提取微生物总 DNA 可分为2个步骤: (1) 土壤微生物细胞裂解和 DNA 提取; ( 2) DNA 纯化。粗 DNA 的提取和纯化都有许多不同的方法，但往往是纯化得到的样品较少，即便得到纯化的样品，也已经流失了大量DNA片段。目前土壤DNA 提取方法，主要可分为3大类，即物理方法、化学方法、酶裂解法。为了获得更高纯度的DNA，一般会结合使用这3种方法[9]。

Purohit等[10]采用pH 9.0的50 mmol/L Tris-HCl对预萃取之前的核酸进行洗涤，从而提高提取率。此外，加入苯酚或氯仿等措施也能提高DNA提取效率。赵裕栋等[9]通过比较高温裂解法、SDS-CTAB 原位裂解法和酶裂解法这3种方法的优缺点，同时参考提取纯培养微生物基因组DNA 的方法，提出了优化的土壤微生物DNA 提取方案。这种方案主要在以下几个关键步骤进行了优化处理：(1)增加了预处理步骤。先过滤，然后在裂解细胞前，加入DNA 提取液，将样品放置在37 ℃ 摇床(180 r/min)振荡30～45 min。可使土壤DNA提取率和提取效果更佳。(2) 采用SDS-溶菌酶法裂解微生物细胞，并优化了裂解时间和处理时间。详细条件见原文献。(3) 完成微生物细胞裂解后，直接加入1 /5 体积的氯仿以除去蛋白质，并防止DNA重新吸附在土壤颗粒。(4) 选 择 20% PEG，2.5 mol/L NaCl 4 ℃ 过夜，来沉淀DNA，以减少 DNA 样品杂质。(5)利用 PVPP 柱纯化DNA 粗品。DNA样品提取后，需要对提取效率和纯度这2个关键性指标进行检测。检测DNA 样品纯度的指标有 A260 /A280，主要用来检测蛋白质和酚类物质的污染情况，理想比值在1.8～2.0 之间；利用上述方案所得的DNA 纯度较高。

腾应等[11]在研究农田土壤DNA的快速提取中，提出利用FastPrep®核酸快速提取仪和相应的Fastprep试剂盒，能够快速释放和纯化土壤中的DNA。这个系统在国内应用的报道还是鲜有，其不仅具有高效、快速等优点，同样能得到较高纯度的土壤DNA[12]。目前，大多研究采用土壤DNA提取专用试剂盒。但是，由于这类专用试剂盒纯化强度往往过大，容易导致一些弱势微生物种群的DNA信息的流失，对于多样性研究就失去意义。因此，这方面的优化是此技术的难点。

2.2 PCR扩增过程及优化

在PCR扩增中，选择合适引物至关重要。对于原核微生物的研究一般选择16S rDNA为扩增引物比较合适，Evans 在对真菌的研究中，则采用18S rRNA。有许多研究表明，18S rRNA更能反映真菌群落特征。选择16S rDNA有以下几个优势：(1)任何一种原核生物体都具有16S rDNA，各物种具有自己的独特序列；(2)长度适中，约1 500 个核苷酸长，适合用作分类学研究；(3)目前基因资料库有完备的16S rDNA基因资料[1]。许多研究表明，扩增16S rDNA中可变区V3及V3～V5区的引物为最佳引物选择区。因为V3区PCR-DGGE条带数最多，分离效果最好[13]。DGGE检测的DNA片段最适长度为200～900 bp，对于200 bp左右的片段(V3区)分离效果最好，但缺乏分类信息；450～500 bp左右片段(V3～V5区或V6～V8区)的分类信息相对更丰富[13]，如果要求较高的分类水平，应该选择968f/1401或341/926r作为引物。Chika利用引物968f-GC和1378r扩增细菌16S rRNA，而利用引物NS1和GC扩增真菌18S rRNA。值得注意的是，常规的DGGE电泳技术对于长度超过500 bp的DNA片段序列的变化情况，检出率仅有50%。因此要得到优化的电泳图像，就需要控制DNA片段序列长度在合适的范围。

目前为了使DGGE检出率提高到100%，通常在一侧引物的5′端设计增加一段富含GC的区域。这种技术称为“GC夹板”，其长度通常为30～50个核苷酸[13]。研究表明，使用“GC夹板”技术后，PCR产物在胶板上分离效率大大提高。

如何设置PCR的反应条件参数也是至关重要。PCR反应一般采用降落PCR策略，其常见的反应条件为94 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，55～65 ℃退火30 s或1 min，72 ℃ 2 或3 min延伸，20个循环，其中每个循环后复性温度降低0.5 ℃。再10个循环，反应条件同上。最后在72 ℃下延伸7或8 min。根据Gelsomino等的报道可对反应体系稍作修改[14]：将启动温度和时间改为95 ℃ 15 min(与热启动酶匹配)。真菌PCR循环参数为95 ℃预变性15 min，95 ℃变性1 min，57 ℃退火1 min，72 ℃ 2 min延伸，35个循环，68 ℃延伸保育10 min，后冷却至4 ℃。

2.3 DGGE分析过程及优化

DGGE分析过程的成功与否直接影响微生物的条带图谱，因此需要确定最佳电泳温度和时间、凝胶浓度和变性剂梯度以及染色剂的选择。

不同电泳温度和时间对于电泳的效果会产生很大的差异，最佳解链温度是由平行凝胶电泳试验确定的，而电泳时间是由DNA的分辨情况来确定[5]。电泳温度通常要求低于样品解链区域的Tm(解链温度)值，大多数DNA片段50～60 ℃比较适合。电泳时间同样受凝胶浓度、电泳时电压等因素影响，Muyzer等[15]提出，利用时间进程试验，能够确定最佳电泳时间(将待测样品以恒定的时间间隔在同一块凝胶上电泳，获得样品最大分辨率的时间)。Kauppi等[16]在D CodeTM系统(Bio-Rad Inc., Hercules, CA, USA)中，对森林土样微生物DNA扩增产物采用80V电压，电泳16～18 h，得到了较好的效果。

凝胶浓度是根据基因片段大小确定的，当片段在200 bp时采用8%的凝胶，片段达到500 bp时用6%的凝胶 。变性剂浓度梯度可利用垂直变性梯度试验研究DNA片段的解链性质，从而确定合适的变性剂梯度范围。对于16S rDNA V3区被广泛使用的变性剂梯度范围是30%～60%，对不同土壤类型、不同基因片段，该范围会有所差异。 Cycon等[17]在对土壤细菌群落进行DGGE进行分析时，利用40%～70%梯度范围，取得了良好的条带图纹。而Song等[18]在对土壤真菌18S rDNA的PCR产物进行电泳时，梯度则采用了25%～45%。

另外，染色方式多种多样，包括EB，SYBR Green I 和银染等[19]，各有其优缺点。目前EB染色法成本低，易操作，已成为运用最广泛的方法，其灵敏度可以满足一般生态学研究。而SYBR Green I染色法灵敏高，至少可检出20 pg DNA，高于EB染色法25～100倍，价格比银染便宜。如果需要更高的灵敏度可以使用银染，其灵敏度比EB高200倍。王静等[20]运用银染获得了较好的效果，但是银染过后的条带由于DNA不易回收，无法进行后续的杂交分析。

2.4 电泳图谱照片的数据分析及优化

目前图谱数条带分析软件已很多，如Gel-Pro Analyzer，Quantity One和ImageTool等[21]。而近年来Image LabTM软件得到越来越广泛的应用，此软件可以运行 Gel DocTMEZ 图像仪以及Gel Doc XR+ 和 ChemiDocTMXRS+ 成像系统，能更优化地采集和分析凝胶电泳和印迹膜的数字图像和数据。流程如下：样品放好后，自动化流程开始采集并优化图像数据，然后分析凝胶或印记膜的参数特征，最终给出详细的报告，这一过程简便快速只需数秒钟，并且Image Lab软件的应用不要求操作人员有任何成像经验即可得到优化的凝胶和印迹膜图像。

通过分析软件，可得到原始DGGE图谱数据。利用原始数据进行深入分析，可采用许多经典的多元变量的统计学方法。目前最常用的方法是非加权算术平均聚类分析法(UPGMA)，可生成直观的聚类树。另外，多维尺度分析(Multidimensional scaling，MDS)和主成分分析(Principal component analysis，PCA)也越来越多应用于图谱分析，Araya等[22]采用MDS方法得到了细菌和真菌的动态变化图示，很好地反应变化规律。经SPASS、SAS等常用的统计分析软件可得出Shannon-Weiner多样性指数(H’)，均匀度(E)，丰富度(R)和优势度(C)，这些指标可以从不同角度反映群落结构特征的量度值。也可利用Matlab(优化程序文件获得途径http:emuch.net/htm1/201206/4582362.html)进行相似度、多样性指数以及聚类分析。

3 总结

尽管PCR-DGGE已经是相对成熟的一种可分析微生物群落的多样性及动态变化的基因指纹技术，它在应用于土壤生态学研究中仍有许多需要优化及探索的技术问题。第1，土壤总DNA快速提取及纯度优化。可利用物理方法、化学方法、酶裂解法有机结合得到优化提取方案。第2，PCR反应体系及条件优化。引物一侧增加“GC夹板”可使分离效率大大提高，根据Gelsomino的报道[14]所修改的系数能得到较优化的PCR产物。第3，DGGE过程优化。DGGE电泳电压和时间，农田土壤电泳可采取150V电压6.5 h；森林土壤可采用80V电压16～18 h。对16S rDNA V3区电泳时可使用变性剂梯度范围30%～60%，对土壤真菌18S rDNA，梯度可采用25%～45%，针对不同环境土壤可做调整。第4，电泳图条带分析优化。采用Image Lab软件可快速得到优化图像数据以及凝胶或印记膜的参数特征。在样品相似度、多样性指数或聚类分析时，可采用Matlab优化程序。

[1] Yu Z, Morrison M.Comparisons of different hypervariable regions of rrs genes for use in fingerprinting of microbial communities by PCR-denaturing gradient gel electrophoresis [J].Applied Environmental Microbiology,2004(70): 4800-4806.

[2] Brock T D.The study of microorganisms in situ: progress and problems [J].Symposium of Society of Genetical Microbiology, 1987(41): 1-17.

[3] Amann R I, Ludwig W, Schleifer K H.Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation[J].Microbiology Review, 1995,59(1): 143-169.

[4] Liu W T,Marsh T L,Cheng H, et al.Characterization of microbial diversity by determining terminal restriction fragment length polymorphisms of genes encoding 16S rRNA[J].Applied Microbiology,1997(63):4516-4522.

[5] 张宝涛,王立群,伍宁丰,等.PCR-DGGE技术及其在微生物生态学中的应用[J].生物信息学,2006(3):132-134+142.

[6] Burr M D, Clark S J, Spear C R, Camper A K.Denaturing gradient gel electrophoresis can rapidly display the bacterial diversity contained in 16S rDNA clone libraries[J].Microbial Ecology, 2006, 51(4):479-486.

[7] Donner G, Schwarz K, Hoppe HG,et al.Profiling the succession of bacterial populations in pelagic chemoclines[J].Archival Hydrobiology, 1996(48): 7-14.

[8] Hugenhdtz P, Goebel B M Pace N R.Impact of cuture independent studies on the emerging phylogenetic view of bacterial diversity[J].Journal of Bacteriology,1998,180(18):4765-4774.

[9] 赵裕栋,周 俊,何 璟.土壤微生物总DNA提取方法的优化[J].微生物学报,2012,52(9):1143-1150.

[10]Purohit H J, Kapley A, Moharikar AA, et al.A novel approach for extraction of PCR-compatible DNA from activated sludge samples collected from different biological effluent treatment plants [J].Journal of Microbiology Method,2003(52):315-323.

[11]滕 应,骆永明,赵祥伟,等.重金属复合污染农田土壤DNA的快速提取及其PCR-DGGE分析[J].土壤学报,2004,41(3):343-347.

[12]何寻阳,王克林,于一尊,等.岩溶区植被和季节对土壤微生物遗传多样性的影响[J].生态学报,2009,29(4):1763-1769.

[13]罗海峰,齐鸿雁,薛 凯,等.在PCR-DGGE研究土壤微生物多样性中应用GC发卡结构的效应[J].生态学报,2003(10):2170-2175.

[14]GelsominoA,CaccoG.Compositionalshiftsofbacterialgroupsinasolarizedandamendedsoilasdeterminedbydenaturinggradientgelelectrophoresis[J].SoilBiology&Biochemistry, 2006, 38(1): 91-102.

[15]MuyzerG,SmallaK.Applicationofdenaturinggradientgelelectrophoresis(DGGE)andtemperaturegradientgelelectrophoresis(TGGE)inmicrobialecology[J].AntonieLeeuwenhoek, 1998,73:127-141.

[16]KauppiS,RomantschukM,StrömmerR,etal.Naturalattenuationisenhancedinpreviouslycontaminatedandconiferousforestsoils[J].EnvironmentalScienceandPollutionResearch, 2012(191):53-63.

[17]CycońM,MarkowiczA,Piotrowska-SegetZ.StructuralandfunctionaldiversityofbacterialcommunityinsoiltreatedwiththeherbicidenapropamideestimatedbytheDGGE,CLPPandr/K-strategyapproaches[J].AppliedSoilEcology, 2013(72):242-250.

[18]SongAP,ZhaoS,ChenSS,etal.Theabundanceanddiversityofsoilfungiincontinuouslymonocroppedchrysanthemum[J].TheScientificWorldJournal, 2013(63):2920-2927.

[19]SmallaK,WielandG,BuchnerA,etal.Bulkandrhizospheresoilbacterialcommunitiesstudiedbydenaturinggradientgelelectrophoresis:Plant-dependentenrichmentandseasonalshiftsrevealed[J].AppliedEnvironmentalMicrobiology,2001(67):4742-4751.

[20]王 静,何 钢,王 蕾,等.PCR-DGGE法研究新型氧肥对水淹胁迫下土壤细菌多样性的影响[J].生物技术通报,2013(4):152-157.

[21]邢德峰,任南琪.应用DGGE研究微生物群落时的常见问题分析[J].微生物学报, 2006, 46(2): 331-335.

[22]ArayaR,TaniK,TakagiT,etal.BacterialactivityandcommunitycompositioninstreamwaterandbiofilmfromanurbanriverdeterminedbyfluorescentinsituhybridizationandDGGEanalysis[J].FEMSMicrobiologyEcology, 2003(43): 111-119.

ProceduresandoptimizationofPCR-DGGEapplyingtotheresearchofsoilecology

XU Wen-huan1, RUAN Hong-hua2*

(1.College of Forestry, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China;2.Key Laboratory of Forestry Ecological Engineering of Jiangsu Province, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China)

Soil microbial diversity has

more and more attention in the research of ecology.As one of the techniques which can be applied to present the diversity of microorganism, PCR-denaturing gradient gel electrophoresis(PCR-DGGE) has its own feature and has been widely used in various fields.So far, there were so many reports on the use of this technology but few ones on the summary of detailed operation procedures.During the operation procedures, there were some technical problems including how to extract and purify soil DNA, how to set the parameters of the conditions of PCR, how to set the condition of DGGE electrophoresis, how to analyze the atlas and data and so on.The procedures of PCR-DGGE applying to the research of soil ecology, as well as method to optimize critical procedures and the direction of optimization, were reviewed in this paper.

PCR-DGGE; Soil microorganism; Ecology; Procedure; Optimization

1001-7380(2014)04-0046-04

2014-05-09；

2014-05-26

国家自然科学基金项目(31170417)；江苏省研究生培养创新工程项目( CXZZ_110510)；江苏优势学科建设和现代林业协同创新项目；江苏省自然科学基金青年专项项目(BK20130974)

许文欢(1991-)，男，福建泉州人，在读硕士，研究方向：土壤生态学。

*通信作者：阮宏华(1963-)，男，教授，博士生导师，研究方向：森林生态学、土壤生态学。E-mail: hhruan@njfu.edu.cn。

S154.1

A

10.3969/j.issn.1001-7380.2014.04.012