血管性痴呆肾虚证与蛋白指纹图谱的相关性研究＊

江 敏，朱爱兰，杨梅玉，赵素萍，吴松鹰（福建中医药大学附属第二人民医院：.中心实验室；.脑病科，福州 350003）

血管性痴呆患者占所有痴呆患者的10%～50%，是国内老年人的多发病和常见病［1］。血管性痴呆的病因包括缺血性、出血性脑血管病以及急、慢性缺氧性脑病等脑血管病，其中缺血性脑血管病是引起血管性痴呆的主要原因。本研究以对照研究的方法，采用基于表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱（SELDI－TOF－MS）的比较蛋白质组分析技术，初步构建了脑梗死后具有不同证候特征的血管性痴呆患者的蛋白指纹图谱及其辨证诊断模型，旨在从蛋白质水平揭示血管性痴呆的物质基础，为中医证候的客观化、规范化研究提供思路，推进中医辨证向客观化、规范化和标准化的方向发展。

1 资料与方法

1.1 一般资料 于福建省第二人民医院就诊的脑梗死后继发血管性痴呆的患者47例，所有患者均符合美国国立神经系统疾病与卒中研究所和瑞士神经科学研究国际协会（NINDSAIREN）制定的血管性痴呆诊断标准，其中脑血管病的诊断符合1995年第四次全国脑血管学术会议制定的脑血管病诊断标准。患者均经头颅CT和（或）MRI检查确诊；发病前无肯定记忆及情感异常，神志清楚，无明显语言障碍，能配合完成各项量表的调查；Hachinski缺血评分（HIS评分）≥7分；简易精神状况检查评分（MMSE评分）提示有认知损害，其中未接受学校教育者（文盲）评分不超过17分，接受学校教育的年限不超过6年者（小学文化程度）评分不超过20分，接受学校教育超过6年者（中学或以上文化程度）评分不超过24分。排除有意识障碍、失语者，文盲、严重视力或听力障碍、既往有精神病史、大量饮酒或滥用药物、头颅创伤及其他在发病前已存在或疑似存在认知障碍的患者，抑郁症患者，HIS＜4分且诊断为阿尔茨海默病（AD）的患者，诊断为血管性痴呆但肾虚证候得分小于7分的非肾虚型患者，合并严重心、肺、肝、肾功能障碍及重度内分泌疾病、重度感染性疾病等其他疾病的患者，临床资料不完善或数据不可靠的患者。纳入的47例患者中，男24例、女23例，年龄59～85岁，平均73.2岁；按2002年颁布的《中药新药临床研究指导原则》中关于肾虚证的诊断标准，将47例血管性痴呆患者按肾虚证与非肾虚证分为两组，其中肾虚证组患者30例，男14例、女16例，年龄63～81岁，平均74.3岁，非肾虚证患者17例，男10例、女7例，年龄59～85岁，平均70.8岁。同期于本院体检健康者13例纳入对照组，男7例、女6例，年龄58～83岁，平均72.5岁。各研究组间受试对象年龄分布、性别构成等一般资料比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 仪器与试剂 美国Ciphergen Biosystems公司生产的Protein Biology System（PBSⅡc）型质谱分析仪、蛋白芯片阅读仪及配套试剂，美国Ciphergen Biosystems公司生产的CM10型蛋白质芯片及芥子酸（SPA）试剂。

1.3 方法

1.3.1 标本收集与预处理 采集患者及健康者外周血后立即放入4℃冰箱静置30min；经高速低温离心后，在冰块上将分离的血清标本快速转移至新的离心管中，并立即放入－70℃冰箱保存待测。标本测试前，将血清标本置4℃冰箱中待其完全融化，4℃条件下12 000r／min离心10min；吸取3μL血清标本加入6μL的缓冲液｛9mol／L的尿素，2%的3－［（3－胆酰胺基丙基）二甲基铵基］－1－丙磺酸盐（CHAPS），50mmol／L的三－（羟甲 基）氨 基 甲 烷 盐 酸 （Tris－HCL），1% 的 二 硫 苏 糖 醇（DTT），pH9.0｝混匀；冰浴振荡30min，期间每隔5min用手指轻弹混匀1次；向9μL稀释标本中加入108μL醋酸钠（NaAc）缓冲液（50mmol／L的 NaAc，pH4.0），振荡器上混匀待用。

1.3.2 芯片预处理、上样和洗脱 将芯片安装于加样器内，并将200μL醋酸钠缓冲液加于芯片之中，振荡5min，弃去缓冲液后重复上述操作1次；向每个加样孔中加入100μL稀释血清标本，室温振荡孵育1h；弃去未结合的血清标本，每孔加入200μL醋酸钠缓冲液，振荡5min，弃去缓冲液后重复上述操作1次；每孔加入200μL高效液相色谱（HPLC）专用水，立刻弃去；卸下加样器，待芯片表面自然晾干后，每点各加饱和SPA 2次，每次0.5μL，2次点样之间需待芯片表面风干后再次点样。

1.3.3 芯片检测、数据采集和参数设置 采用PBS－Ⅱc型蛋白芯片阅读仪读取信息，用加有 All－in－one标准蛋白质的NP20芯片校正仪器至0.1%范围内。芯片阅读仪参数设置如下：激光强度175，检测灵敏度8，优化范围2 000～10 000，最高相对分子质量50 000，芯片上的每个点采集130次。用Ciphergen Protein Chip 3.1.1软件收集数据。

1.3.4 数据分析 （1）指纹图谱标准化：用总离子流校正所有图谱，即假定建模所用的所有血清标本蛋白指纹图谱的总离子流是相同的，根据此假设对每个图谱的每个蛋白峰的峰值做相应的调整，以减少不同芯片、仪器状态波动等因素引起的试验误差。（2）用Biomarker Wizard软件快速计算相同质荷比的蛋白峰值在肾虚证患者与非肾虚证患者之间的比较差异。选择信噪比（S／N）＞8和在所有图谱中出现频率超过10%的峰作为有效蛋白峰。为避免遗漏小的蛋白峰，将S／N＞5和相对分子质量偏差小于0.5%的峰也标记为有效蛋白峰。再根据方差分析的原理计算总图谱内两组患者间相同质荷比蛋白表达差异的P值（以Excel表输出差异蛋白的相对分子质量和相对强度）。（3）中医辨证诊断模型的建立和验证：采用Biomarker Wizard软件，对脑梗死后发生血管性痴呆的47例患者血清标本与13健康者的血清标本检测结果进行初步的聚类和峰值分析，获得脑梗死后发生血管性痴呆患者和健康者的差异性蛋白峰。在此基础上，利用数理统计学方法进一步分析肾虚证组血管性痴呆患者与非肾虚证组血管性痴呆患者蛋白组分变化，从而为构建血管性痴呆蛋白指纹图谱的辨证诊断模型提供依据。

2 结 果

对脑梗死后发生血管性痴呆的患者与健康者的血清蛋白图谱结果比对，采用Biomarker Wizard软件进行初步聚类和峰值分析后，共捕获166个蛋白峰，其中25个不同质荷比的蛋白峰在脑梗死后发生血管性痴呆的患者与健康者中的表达量比较，差异有统计学意义（P＜0.05），其质荷比的最低值为1 061.308，最高为44 899.64。在25个表达量具有统计学差异的蛋白中，4个在血管性痴呆患者中高表达，21个为低表达。对血管性痴呆肾虚证患者与非肾虚证患者的血清蛋白图谱结果进行比对，采用Biomarker Wizard软件进行初步聚类和峰值分析后，发现15个不同质荷比的蛋白峰在血管性痴呆肾虚证患者与非肾虚证患者中的表达量比较差异有统计学意义（P＜0.05），其质荷比最低值为1 010.592，最高为43 860.86。在15个表达量具有统计学差异的蛋白中，10个在血管性痴呆肾虚证患者中高表达，5个为低表达。质荷比为4 656.02和11 096.46的两个蛋白峰的表达量，在患者、健康者之间及不同症候型患者间的比较差异均有统计学意义（P＜0.05），其余蛋白峰则无此表现。血管性痴呆肾虚组患者与非肾虚组患者的蛋白峰相对强度的部分蛋白聚类差异图也显示，这部分蛋白峰对患者的分组具有意义。

3 讨 论

血管性痴呆的发生、发展与证候密切相关，临床工作中准确把握证候的实质有助于有效地为患者拟方用药。1990年全国中医学会老年医学会和内科学会制定的《老年呆病的诊断、辨证分型及疗效评定标准》及2002年版的《中药新药临床研究指导原则》中，关于痴呆的中医辨证分型均包括髓海不足、肝肾亏虚、脾肾两虚及肾虚髓减的肾虚相关证型，2002年由中国中医药学会内科延缓衰老专业委员会制定的《血管性痴呆诊断、辨证及疗效评定标准（研究用）》更明确提出了肾虚的证候名。目前辨证分型的依据仍然依靠全身症状、舌脉等主观指标，其内容也多是以医生及患者的主观感觉为依据，缺乏必要的实验室客观依据。对血管性痴呆的研究多从某个指标或某方面的指标入手，无法反映血管性痴呆中医证候的物质基础。辨证首重虚实，虚以肾虚为特征，实以痰浊、淤血、火热为表象［2］，在年老患者中，常同时存在气血阴阳的虚衰，有时甚至常被痰、瘀等标实的证候所掩盖而影响辨证［3］。因此，利用现代科技手段进行中医证候的客观化研究对指导临床辨证和施治具有重要意义。

随着蛋白质组学技术的不断发展，有学者提出把中医的证当作疾病一定阶段某一特定状态下表达的蛋白质组功能的总和，证的本质可以认为是患者个体基因型及其表达结果，从而提出了证候基因学和证候蛋白质组学理论。证候蛋白质组学理论从蛋白质水平探讨中医证型分类的基因表型、蛋白质表型，通过收集、整理各种证的蛋白质组学特异性指标，最终阐明中医证的实质、证的辩治及证的演变规律等。

蛋白质组学是对细胞或组织（包括体液）中的蛋白质的种类及数量进行分析的新兴学科［4－5］。蛋白质组学以细胞内所有蛋白质及其动态变化规律为研究对象，能提供更多的生命信息，可在更深入、更贴近生命本质层次基础之上发现和理解生命活动规律以及重要生理、病理学的本质，为后基因时代的生命科学研究开辟了新的天地，是后基因时代生命科学研究的热点领域［6］。SELDI－TOF－MS综合采用了蛋白芯片和质谱分析技术，可直接从蛋白质种类及数量的变化层面探讨疾病的发生过程，有助于对包括血清、组织等在内的大批量临床标本进行高效分析，使寻求用于临床诊断的特异、敏感的生物学标志物成为可能［7］。

SELDI技术在疾病的诊疗、防治方面有着广泛的应用前景［8］。各种人类疾病都有特征性的蛋白质指纹图谱的动态变化，在疾病的不同阶段（不同的证候），蛋白质水平可能已经发生了变化，尤其是随着疾病的不断进展，患者体内蛋白质的表达也在不断地发生变化［9］。因此，将SELDI质谱技术应用于蛋白质组学研究领域，可以获得大量、完善、动态的蛋白质指纹图谱，并能反映疾病治疗前后或治疗过程中患者体内蛋白质的变化，能够为诊断学和治疗学的理论和应用基础研究奠定更为坚实的基础［10］。

本研究采用SELDI－TOF－MS技术对47例脑梗死后发生血管性痴呆的患者及13例健康者进行了血清蛋白质分析，并采用Biomarker Wizard软件对所捕获到的166个蛋白峰进行了初步聚类分析，发现25个表达量具有统计学差异的质荷比峰值（P＜0.05），其中质荷比最低值为1 061.308，最高为44 899.64。在25个具有统计学差异的蛋白中，4个在血管性痴呆患者中高表达。通过血管性痴呆肾虚证患者和非肾虚证患者间的比较，则发现15个不同质荷比的蛋白峰在血管性痴呆肾虚证患者与非肾虚证患者中的表达量比较差异有统计学意义（P＜0.05），其中质荷比最低值为1 010.592，最高为43 860.86。在15个表达量具有统计学差异的蛋白中，10个在血管性痴呆肾虚证患者中为高表达，5个为低表达。在患者与健康者之间及不同证候患者之间的两次比较中，发现两个蛋白峰（质荷比分别为4 656.02、11 096.46）都出现了，其余蛋白峰则无此表现。质荷比为4 656.02的蛋白峰在健康者中的表达水平高于其在血管性痴呆患者中的表达水平，在血管性痴呆非肾虚证患者中的表达水平又高于其在肾虚证患者中的表达水平。然而，质荷比为11 096.46的蛋白峰则恰恰相反，其在血管性痴呆患者中的表达水平高于在健康者中的表达水平，在肾虚证患者中的表达水平又高于非肾虚证患者。由此可见，联合应用质荷比为4 656.02和11 096.46的两个蛋白峰建立的辩证诊断模型，可用于血管性痴呆肾虚证型与非肾虚证型的鉴别，并且具有较高的敏感性和特异性，也具有一定的临床诊断意义。

本研究的不足之处：（1）因经费、时间等原因，本研究涉及的患者例数有限，且未对血清标本中表达水平存在差异的相关蛋白进行分离及鉴定，仅为临床初探性研究，若增加患者例数后进行更为深入的分析，能够提高针对标志物的分析准确性。（2）对于不同的标本，根据检测的目标不同采取不同类型的芯片捕获方式，理论上可以捕获所有的相同性质的蛋白质，但实际上仍有少量的蛋白质分子未能与表面探针相结合。使用SELDI－TOF－MS系统进行检测，仅能提供蛋白质的相对分子质量，无法提供详细的C端、N端的氨基酸序列，也无法确定蛋白质的构型，因此需要将蛋白质充分纯化后，用蛋白酶消化点样于芯片上的蛋白质，通过分析肽段，并结合生物信息学方法对氨基酸序列进行鉴定［11］。除此之外，SEDLI－TOF－MS系统还存在以下缺陷：（1）并非所有的蛋白质都能被同等显示，相对分子质量小于30 000的蛋白质可被有效检测，但对于相对分子质量大于30 000的蛋白质，其检测灵敏度明显下降。（2）由于不同蛋白质的浓度相差巨大，高浓度蛋白质的出现干扰了低浓度蛋白质的定量和定性检测，因此有必要解决如何将高浓度蛋白质通过有效的预先分离，从而更好地检测低浓度蛋白质的问题。（3）蛋白质峰强度某些情况下受蛋白质与芯片结合力强弱的影响，也很难依此进行蛋白质的准确定量。（4）虽然SELDI系统是一种高通量技术，但多数操作步骤均需人工完成，包括标本的储存、处理及缓冲液的配制、参数的设定等，难免有较大的人为因素影响检测结果。（5）标记物蛋白质仍然需要可靠性及准确性更高的串联质谱进行鉴定。（6）设备、耗材及分析软件等费用均较昂贵，且质谱分析需要大量后续工作的支持，限制了该技术的进一步推广应用［12－14］。

综上所述，本研究显示利用SELDI－TOF－MS技术能够为中医证候的客观化、规范化研究提供思路，推进中医辨证向客观化、规范化和标准化的方向发展。

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