鸡新城疫血凝抑制试验的质量控制

赵平伟 ，费 强

（1.山西省饲料兽药监察所，山西太原030027；2.山西省汾阳市动物疫病预防控制中心，山西汾阳 032200）

鸡新城疫血凝抑制试验（HI试验）是诊断新城疫疫病、掌握鸡群动态、制定免疫程序的重要手段，因为其快捷、成本较低、便于操作、能够处理大量的样品，所以成为动物疫病实验室常用的检测方法。但是很多从业人员缺乏系统的血清学检测知识，容易出现试验结果偏差，甚至误判，造成新城疫的发生和流行，给鸡场带来巨大的经济损失。

因此，正确运用和熟练掌握试验方法至关重要。笔者在长期实验室工作中反复操作，不断摸索，积累了一些经验，原与大家共同探讨。

1 新城疫血凝试验和血凝抑制试验的原理和方法

新城疫病毒能选择性地使某种或某几种动物的红细胞发生凝集，此即为新城疫血凝试验（HA试验）。方法是用鸡红细胞与新城疫标准抗原作用，检测出标准抗原血凝单位，为血凝抑制试验作准备。而红细胞凝集现象可于新城疫病毒悬液中加入特异性免疫血清所抑制，即为血凝抑制试验。方法是将检测出血凝单位的新城疫标准抗原配制后与受检血清反应，再加入红细胞作用。血凝抑制试验用于检测受检血清抗体血凝抑制滴度，判定受检血清抗体是否为阳性。

2 器材的选择

2.1 反应板、移液器、吸头的选择

为使微量反应板、移液器、吸头保持最佳工作状态，应建立选择、使用、维护的标准操作程序，条件允许的情况下，微量反应板、吸头尽量使用一次性产品。

反应板最好用96孔V型板，切记不可用试管刷刷板，以免破坏孔内壁的光滑性。板必须刷净，不干净的板会出现自凝现象。试验完毕后，用自来水反复冲洗反应板，浸在2％盐酸溶液中1小时，再用自来水冲洗，浸入1％氢氧化钠 15分钟后，拿出来用自来水冲洗，最后浸泡于蒸馏水中30分钟以上，捞出后将孔内水甩干净，倒放于37℃恒温箱中烘干备用。对底部磨损严重的反应板要及时淘汰。

实验时应选用数字式单道和多道移液器。平时要做好移液器的保养及校验工作，这对保证移液器的准确性非常重要，每次使用完毕，要将移液器量程调至最大刻度，以保持移液器弹簧的最好灵敏度，使用前核对刻度容量与实际容量是否相符。

吸头应光洁平滑，能与移液器上的吸头套密封完好。

2.2 样品的采集与保存

从1日龄测定新城疫母源抗体开始，定期采样监测，早期每隔1～2周监测一次，以后随日龄的增大每3～4周测定一次。样品应具有足够的数量和一定的代表性，一般万只以上鸡群按0.5％采样，小型鸡群按1％采样。采样时应从鸡群的多个位置抓鸡，采集病、弱鸡只血样应单独标明。

随机采样时，应对鸡群品种、日龄、疫苗种类、疫苗厂家、生产批号、免疫时间、免疫途径、采样数量等详细登记，以便检测后进行结果分析和判断，为新城疫免疫提供数据。

在翅静脉采血时，多用一次性塑料管引流采血，其优点是简单、快速，对鸡只损伤小，封口后便于携带、存放和分离血清。采样时采血量不得少于管长的2/3，否则血量过少，分离到的血清不足，影响监测结果。采血后，塑料管的一端要随即密封，以免漏掉血清。如果用注射器采血，可用清洁、干燥无菌的小瓶盛装，血液要放成倾斜，不能直立，否则不易分离出血清。另外还要在塑料或小瓶上标明编号，以便区分。

除了离心分离血清外，如果想让血清自然析出，不要马上将血清放于冰箱内，要在室温（20℃左右）下放置2～3小时，待血清析出后，再放入4℃冰箱内，这样不但有利于血清的析出，又可避免血清高温下污染变质和溶血现象发生。

2.3 试剂的配制

鸡新城疫血凝抑制试验最常用的稀释液为0.85％的生理盐水，要求其无菌、无杂质。稀释液PH值调整为7.0时，红细胞沉降最充分，图像最清晰，HI滴度值最大。若稀释液偏酸性，易使红细胞溶解；偏碱性时，吸附于红细胞上的病毒易脱落。

不同鸡的红细胞对新城疫病毒的敏感性不同，有的鸡红细胞有自凝现象，有的鸡红细胞沉降慢，故试验时最好采3～4只成年健康公鸡的血液混合，并用生理盐水多次充分洗涤。红细胞悬液的浓度要尽量准确，如果浓度偏低，HA效价就偏高，HI效价就偏低；相反地，如果红细胞悬液浓度偏高，HA效价就偏低，HI效价就偏高。红细胞悬液使用时最好现用现配。

由于新城疫HI试验的结果判定是以完全抑制4单位抗原（4HAU）的血清最高稀释倍数作为HI滴度的，检测用的抗原稀释为4单位抗原后还需要一次回归实验，即检测4单位抗原是否准确。抗原回归步骤如下：取50微升的生理盐水加入微量反应板的第1～4孔；将配制的4单位抗原50微升加入第1孔，然后依次倍比稀释至第4孔，最后弃去50微升；4个孔再补加50微升生理盐水，最后4个孔加红细胞悬液50微升并混匀，室温静置30分钟观察结果。若第1、2孔红细胞完全凝集，第3孔出现75％凝集，说明4单位抗原配制准确，可用于HI试验。若第3孔也出现完全凝集，说明HA效价提高了一个滴度，需等量稀释抗原；若只有第1孔出现完全凝集，说明HA效价降低了一个滴度，抗原量需要加倍。如果标准抗原血凝价偏高，测定的血清抗体效价将偏低，反之待测定的血清抗体效价偏高。所以标准抗原的配制及检测的准确性对实验结果产生较大影响。

3 操作中的注意事项

微量移液器使用时有二个阻力位置，压到第一个阻力位置为所调刻度的量值，为吸取液体时使用，再加压力的第二个阻力位置为放液时使用。注意拇指用力，不要在吸取液体时将移液器重力压过第一个阻力位置，否则会造成吸取液体偏多使试验结果不准确。

在新城疫HI试验中有4次加样步骤，即加生理盐水、待检血清、4单位抗原、红细胞悬液。加样时应注意以下几点：移液器吸头需碰触器壁以除去多余的液体；吸头内液面应保持一致；在对被检血清进行倍比稀释时，吸头要插入液面以下，避免产生泡沫；加4单位抗原和红细胞悬液时，吸头要离开液面，最好从后往前加；红细胞悬液在试验时要充分摇匀等。

环境温度对新城疫HI试验值的影响比较大，呈正相关。同时环境温度影响出现结果的快慢，温度高，出现结果快；但温度过高，会出现反应物解离和红细胞溶血现象，所以，实验室应配备空调，将温度控制在20℃～25℃。

在室温下，抗原抗体作用25～30分钟为宜，加入红细胞悬液后，以红细胞对照完全沉淀的前后5分钟内判定结果较好。判定结果偏早，所测得的结果不能反映实际抗体水平；判定时间太迟，红细胞易发生溶血现象，导致试验无效。

4 结果判定

在对照孔出现正确结果的情况下，以完全抑制红细胞凝集的最大稀释度为该血清的血凝抑制滴度。

监测鸡群的免疫水平时，要求新城疫血凝抑制滴度大于或等于4 log2，但是抽检样品若有10％以上出现11 log2以上的高血凝抑制滴度，应考虑鸡群是否受到新城疫强毒感染。

5 试验中常见错误分析

全部凝集：红细胞受到污染或保存时间过长；4单位抗原效价过高或滴加失误；生理盐水受到污染。

整板无凝集：4单位抗原失效；试验中少加4单位抗原步骤；环境温度高，读秒时间拖延。

跳孔：倍比稀释时，操作顺序错乱；使用多道移液器时，每次吸取的液体量不一致；个别孔滴加4单位抗原时遗漏。

整板样品效价为1 log2：操作时遗漏了倍比稀释步骤。