PET凋亡细胞显像探针的研究进展

吴晓燕，王 卉，张锦明，田嘉禾

解放军总医院 核医学科，北京 100853

PET凋亡细胞显像探针的研究进展

吴晓燕，王 卉，张锦明，田嘉禾

解放军总医院 核医学科，北京 100853

细胞凋亡是生命体的一种基本生理机制。活体检测肿瘤组织的凋亡细胞将来可能应用于临床实践，尤其是对肿瘤治疗和预后的预测，对指导肿瘤个体化治疗具有重要的意义。PET作为分子影像显像手段，在凋亡显像研究中具有很大优势。基于凋亡显像的重要性，许多有潜力的PET探针被开发出来，包括正电子核素标记的膜联蛋白Annexin-V，靛红衍生物类Caspase-3抑制剂、疏水性阳离子和Apo-sense化合物，上述探针针对凋亡过程中的不同靶点，能够不同程度地反映出活体组织细胞凋亡状态。

PET；分子探针；凋亡；活体显像

活体凋亡分子影像将来有可能为临床实践提供重要信息，比如协助疾病的早期诊断、监测疾病的进程、评估疾病的治疗效果和协助开展新的疗法[1]。正电子发射体层成像(positron emission tomography，PET)检查作为临床上判断癌症分期、评估治疗方案和监测治疗效果的重要手段，其成像质量高于其他核医学显像仪器，是首选的活体凋亡细胞显像方法，所以开发出能够适用于临床实践的PET凋亡显像探针应用前景较好。目前开发的凋亡分子探针主要应用于光学显像和核医学显像，但目前还没有正电子标记的PET显像剂适用于临床[1]。细胞凋亡程序启动后，细胞发生一系列改变，诸如质膜变化、酶原被激活等，这些改变可以成为显像探针的追踪靶点，根据这些“靶点”的不同，目前应用研究的大部分凋亡探针可大致分成4类： 针对细胞膜上的磷脂酰丝氨酸外翻和磷脂不对称分布的探针，显示Caspase酶活性的探针，显示线粒体膜势能改变的探针和反应膜改变印迹的探针。本文对应用于凋亡细胞显像的PET探针予以综述。

1 针对细胞膜上的磷脂酰丝氨酸外翻的探针

在正常细胞的质膜上磷脂类是不对称分布的，磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)带负电荷的磷脂端朝向细胞膜内侧胞质，在凋亡发生时PS向外翻转显著[2]。这是凋亡过程中普遍存在的现象。细胞受到凋亡诱导后，细胞膜上可迅速出现大量的外翻PS结合位点[3]。分子探针直接结合膜上外翻的PS，可用于凋亡显像。但是因为其他形式的细胞死亡(坏死、自噬)也存在磷脂酰丝氨酸翻转的改变，所以PS外翻是细胞凋亡的非特异性改变。

Annexin V是人类磷脂酰丝氨酸结合蛋白，是目前应用最广的PS直接结合剂，其优点是对凋亡细胞的亲和力非常高，蛋白质序列中通过重组DNA技术引入一段短的带有氨基末端的肽，该处能够连接多个荧光基团或者形成金属螯合剂，直接螯合锝Tc99m，并可在特异位点连接顺丁烯二酰亚胺(18F- maleimide compound)形成衍生物，制备成正电子示踪剂[4-5]。

PET使用最多的同位素为氟18(18F)，其半衰期是110 min，这要求快速而有效的标记。因Annexin-V含有大量需要保护的功能基团，标记时需经过复杂的脱保护步骤。直接标记18F的过程耗时长、不实用，可采用先标记某一基团，如N-succinimidyl 4-18F-fluorobenzoate harbors numerous functional，形成Annexin-V衍生物，再于该衍生物上标记18F的方法[6]。尽管能获得良好的标记率，但这种探针的标记和纯化步骤十分复杂，尤其不适合用于常规临床检测[7]。Annexin-V在体内的清除率缓慢，而且其标记过程耗时较长，除18F以外，长半衰期同位素64Cu或124I(半衰期分别为12.7 h和4.2 d)的标记也有报道研究，但是这些并不适合常规的临床应用[8-9]。

2 显示Caspase-3活性的的探针

细胞凋亡是由蛋白水解级联反应介导的。Caspase是一组半胱天冬氨酸酶，在凋亡发生时，该酶参与凋亡起始、调节和执行下游一系列酶联反应事件[10]。Caspase-3是细胞凋亡的主要执行者之一，该酶的前体存在于胞液中，经由细胞内、外两种途径激活。凋亡过程中发生的大量蛋白质裂解、染色质边集、DNA片段化、细胞核瓦解等事件，Caspase-3的作用是必不可少的[11-12]。所以，检测Caspase-3的活性可用于鉴别组织切片中的凋亡细胞，这类方法是特异的，甚至能在凋亡形态学特征出现之前检测到凋亡。这类探针根据与Caspase-3的反应类型的不同，分为Caspase-3直接拮抗剂类(小分子类)和Caspase-3的底物衍生物类。

2.1 Caspase-3直接拮抗剂类 尽管最初的研究倾向于开发肽结构的拮抗剂，但是取得较大进展的是新型小分子Caspase-3抑制剂。靛红类化合物(5-pyrrolidinylsulfonyl isatin)是一类非肽类的Caspase-3抑制剂，检测Caspase-3的探针是从该类小分子抑制剂衍生而来[13]。细胞内Caspase-3活化后，该靛红类分子的二羰基能共价结合位于Caspase-3活性中心的半胱氨酸残基，起到拮抗Caspase-3的作用[14]。靛红类衍生物反应灵敏，体外Caspase-3的活性半抑制浓度IC50在nMol/L数量级。18F标记的靛红氨苯磺胺类探针研究较多，比如18F-ICMT-11，PET显像实验已经证实该探针的摄取与细胞凋亡正相关[15-16]。此类探针的缺点是腹部器官的非特异性摄取较高，显像质量有待提高[17]。除此之外，还有11C标记的结合Caspase-3的配体，如11C-WC-98和18FWC-IV-3在实验中表现出对凋亡细胞的高亲和力，可在体外抑制分离纯化Caspase-3酶活性。有文献报道在放线菌酮和死亡配体抗体体外诱导的肝凋亡细胞中，有该类探针的累积性摄取，后经组织学评估证实有明确的凋亡发生[13,18]。

限制该靛红抑制剂类探针应用的一大问题是，抑制剂在从体外分离的Caspase-3酶系统到整个细胞再到活体的不同条件下，其对Caspase-3的亲和力有明显下降，而到活体显像时，所需探针的浓度需显著提高才能达到抑制Caspase-3酶的效果[19]。这一现象可能与细胞内或活体的非特异性化学反应有关，靛红类分子的二羰基也能共价结合其他半胱氨酸蛋白水解酶类，如组织蛋白酶类。

2.2 Caspase-3的底物衍生物类 该类分子结构中含有4个氨基酸残基D-E-V-D(Asp-Glu-Val-Asp)的序列，使得该类探针能够被Caspase-3酶特异性识别，显示Caspase-3的活性。这类探针有18F标记的CP-18。初步体内外实验显示18F-CP-18直接反映Caspase-3活性，检测凋亡发生的灵敏度较高，但是动物显像发现腹部本底信号很高[20]。尽管这类探针理论上应用前景较好，但是之前的一些显像实验发现图像有相对较低的信噪比值[21-22]。这可能是因为D-EV-D并不只是Caspase-3的特异识别位点，活体内还存在其他的酶能够识别该类探针，或者在正常生理条件下胃肠道也存在大量的凋亡细胞。

3 显示线粒体膜势能改变的探针

正常细胞的线粒体跨膜负电位水平高，允许阳离子内向移动到线粒体基质，导致亲脂阳离子(疏水性阳离子)聚集于线粒体膜内。该跨线粒体内膜的质子电化学梯度的丧失是细胞凋亡的特征之一[23]。线粒体膜势能的变化可被亲脂阳离子的复位电位水平反映出来。因为细胞内含有大量数目的线粒体，可作为潜在的凋亡有效靶点。实验发现用于凋亡显像的18F标记的器官组织阳离子(18F-fluorobenzyltriphenylphosphonium cation，18F-FBnTP)在星状孢子素诱导的肺腺癌细胞和紫杉醇诱导的乳腺癌细胞中摄取逐渐减少，这是因为体外线粒体数目有限，而且逐渐被破坏，有效靶点逐渐减少，但是在活体的心脏和肾有较高的摄取[24-25]。

该类探针在活体显像不同于其他类探针信号在一段时间内积累增加，而是随着越来越多的线粒体跨膜的质子电化学梯度丧失，摄取速率较快减少，信号也随之很快减少，这造成了应用该类探针显像的困难。所以该类探针应用于心脏和肾这类线粒体高密度分布的器官效果较好，而在低代谢的器官显像效果可能不佳。

4 显示膜改变印迹的探针

凋亡细胞的膜改变印迹是与凋亡相关的复杂细胞变化，包括不可逆的质膜潜能丧失、持久的外部质膜和胞液酸化、维护细胞膜完整性的脂质移行酶系统的激活等，这些协同发生的细胞复合特征可将其与坏死区分开[26-27]。依据此设计的一组新型小分子探针，商品名为Apo-Sense的探针(N，N'-didansylcystine)。该种化合物在凋亡细胞中浓聚量均高于正常细胞两倍左右。显像剂浓聚的可能原因为，早期凋亡细胞的质膜不完整，这类化合物能够进入凋亡细胞而不能进入质膜完整的正常细胞，产生凋亡细胞显像。报道了几种Apo-sense化合物，例如DDC、ML-10、ML-9、NST-732和NST-729，这些化合物在临床前期实验的许多疾病模型中能够较好地显示凋亡细胞，如抗癌药诱导的肿瘤凋亡、肾衰竭模型、局部缺血引起的脑卒中的神经血管凋亡、神经退行性疾病模型等。

PET探针18F-ML-10是Apo-sense家族中的一种小型的化合物，分子量为206[26]。它表现出凋亡细胞的选择性摄取，可能与线粒体跨膜电位破坏、Caspase激活或DNA片段化相关，其摄取机制目前还不清楚。18F-ML-10是第一个应用于临床的PET凋亡细胞探针，临床试验获得了良好的结果[28]。健康志愿者的临床一期试验显示，其在体内有高稳定性、良好的生物分布和安全的剂量范围。临床二期试验中，急性缺血性脑卒中病人神经血管细胞的PET凋亡显像与CT检查所见匹配良好[29-31]。关于该示踪剂的更多临床试验有待开展。

5 结语

近年来，细胞凋亡的生物学研究越来越深入，进一步阐明了凋亡的发生过程，这为凋亡细胞的活体显像研究提供了更多思路，其检测手段也有很大提高。上述总结的4类PET探针各有优势，能够不同程度地反映出活体组织细胞凋亡状态，将来或许能够发展成为应用于临床的凋亡细胞显像探针。

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Advances in radiotracer for PET imaging of apoptosis

WU Xiao-yan, WANG Hui, ZHANG Jin-ming, TIAN Jia-he
Nuclear Medicine Department, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China

TIAN Jia-he. Email: tianjh@sina.vip.com

Apoptosis is a fundamental biologic process. Molecular imaging of apoptosis in vivo may have important implications for clinical practice, especially for treatment and prognosis of malignancies. PET, as a radionuclide imaging method, has an advantage in functional molecular imaging, which plays an important role in apoptosis imaging studies of tumor. In recent years, many PET probes based on the importance of apoptosis imaging are being developed, including positron radionuclide labeled Annexin-V, Caspase-3 inhibitor, Hydrophobic positive ion and the structures targeting various steps of the apoptotic cascade mentioned above can reflect the apoptotic status of living tissue cells.

PET; molecular probes; apoptosis; in vivo imaging

R 455.9

A

2095-5227(2014)10-1075-03

10.3969/j.issn.2095-5227.2014.10.027

时间：2014-06-06 17:17

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20140606.1717.004.html

2014-04-18

科技部重大仪器专项(2011YQ030114)

Supported by the National Major Scientific Equipment Special (2011YQ030114)

吴晓燕，女，在读硕士。研究方向：肿瘤核医学。Email: wxymailbox@sina.com

田嘉禾，教授，博士生导师。Email: tianjh@sina.vip.com