Wnt2在不同肿瘤患者血清中水平的探讨＊

郭变琴，陆芸瑶，黄学梅（重庆市肿瘤研究所检验科 400032）

Wnt信号通路不仅在胚胎发育调控中起重要作用，而且它与人类肿瘤的发生和发展也息息相关，并在多种肿瘤中得到证实，是现今肿瘤研究的热点。目前已发现，人类Wnt基因家族共有19个成员，它们编码的产物均为分泌型糖蛋白，含一段信号肽及23或24个位置保守的半胱氨酸残基［1］。Wnt2是经典Wnt信号通路的成员之一，目前被广泛认为是一种癌基因，该基因定位于染色体7q31.3上。近年相继发现，Wnt2在某些肿瘤中表达上调，如结肠癌、胃癌、食管腺癌等［2－4］。本课题前期研究表明Wnt2在乳腺癌组织中高表达，又基于Wnt2是一种分泌型糖蛋白，作者进一步探讨Wnt2在乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、肺癌、肝癌患者血清中的水平，为深入研究Wnt2在肿瘤中的作用奠定基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择重庆市肿瘤医院住院的肿瘤患者77例作为研究对象，其中乳腺癌38例、卵巢癌10例、宫颈癌8例、肺癌13、肝癌8例。所有患者均为女性且均经病理确诊，所有标本除乳腺癌有2例为术后正接受化疗外，其余病例均为术后复发就诊患者。选择同期在重庆市肿瘤医院健康体检的30例健康成年女性作对照，排除乳腺增生。所有研究对象均征得本人知情同意。

1.2 仪器与试剂人无齿型MMTV 整合位点成员酶联免疫分析试剂盒购于武汉华联科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 标本采集研究对象均于清晨空腹采集肘静脉血，2h内分离血清，分装后于－80℃低温冰箱保存待检；检测前融解，并进一步离心，待检。

1.3.2 检测方法采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测可溶性Wnt2在血清中的水平。（1）96孔酶标反应板中，设标准品10孔（稀释后各孔加样量都为50μL，浓度分别为6、4、2、1、0.5 ng／mL）、空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔；（2）在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μL，然后再加待测样品10μL（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，37℃温育30min，洗板5次，每次均拍干；（3）每孔加入酶标试剂50μL，空白孔除外，37℃温育30min，洗板5次，每次均拍干。每孔先加入显色剂A 50μL，再加入显色剂B 50μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15 min；（4）每孔加终止液50μL，终止反应（此时蓝色立转黄色）。以空白孔调零，450nm 波长依序测量各孔吸光度（A值）；（5）以血清Wnt2标准品的A值为纵坐标（取双复孔浓度的平均值），标准品稀释浓度为横坐标，绘制标准品曲线，根据标准品曲线计算出待测血清Wnt2水平。

1.4 统计学处理采用SPSS17.0统计软件进行分析处理，计量资料以表示，两组间比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

健康者血清中Wnt2水平为（1.23±0.69）ng／mL，乳腺癌患者为（7.22±3.26）ng／mL，卵巢癌患者为（5.55±3.89）ng／mL，宫颈癌患者（8.89±3.68）ng／mL，肝癌组患者（0.02±0.02）ng／mL，肺癌患者为（0.88±0.35）ng／mL；与健康者比较，乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌患者血清中Wnt2水平均明显升高（均P＜0.05），肝癌患者血清中Wnt2水平明显降低（P＜0.05），肺癌患者血清中Wnt2水平无明显变化（P＞0.05）。

3 讨论

Wnts是一类广泛存在的分泌型糖蛋白，相对分子质量约40×103，通过与细胞表面、细胞外基质的联系而体现信使的作用，再通过复杂的信号传递通路控制胚胎早期发育，决定细胞分化、细胞增殖及生长调节，而当其影响因素发生变化使其活化过度或失调时，便会导致机体发育异常或形成肿瘤［5］。目前，Wnt2被广泛认为是一种致癌基因，然而，其在肿瘤中的作用报道不多。有研究证实，食管细胞癌中，肿瘤纤维母细胞分泌的Wnt2通过激活Wnt2－β连环蛋白信号通路，促进食管癌细胞的生长［6］；此外，Wnt2能通过自分泌或旁分泌实途径诱导乳腺上皮细胞形态发生改变［7］；尤其是新近对Wnt2的报道引起了作者极大的兴趣，麻省总医院癌症中心的研究人员通过芯片设备成功捕获了人胰腺癌小鼠模型血液中的循环肿瘤细胞，并分别对胰腺循环肿瘤细胞、原发肿瘤细胞和正常胰腺组织进行了RNA 表达水平分析，结果发现Wnt2基因在胰腺癌中的表达量高于正常组织，尤其在循环肿瘤细胞和转移性细胞中表达量特别高［8］。又鉴于Wnt基因编码的产物为分泌型糖蛋白，并含有一段信号肽，因此作者推测Wnt2可分泌至肿瘤患者血清中。

以往研究者对Wnt2的研究主要聚焦在肿瘤组织或细胞株中，对于肿瘤患者血清中Wnt2的表达水平，尚未见研究报道。本课题组在前期对乳腺癌的研究中发现，Wnt2高表达在乳腺癌组织上皮及间质细胞中。在本研究中，作者进一步收集了乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、肺癌、肝癌的患者血清，并通过ELISA 技术检测Wnt2在血清中的水平，与健康者比较，乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌患者血清中Wnt2水平均明显升高（均P＜0.05），肝癌患者血清中Wnt2水平明显降低（P＜0.05），肺癌患者血清中Wnt2水平无明显变化（P＞0.05）。由此可见，Wnt2在妇科肿瘤患者血清中的水平明显增加。有研究也表明，BRCA1及BRCA2基因是卵巢癌的高危遗传基因。Jazaeri［9］采用cDNA 基因芯片的方法发现携带BRCA2基因的卵巢癌与Wnt2和SFRP4密切相关，该结果也间接提示了Wnt2与卵巢癌的相关性。结合本课题的实验结果，作者推测Wnt2在妇科肿瘤的发生中可能起着重要作用，然而其在妇科肿瘤中的作用机理尚需进一步验证。本研究中作者也发现，与健康人群比较，肝癌患者血清中Wnt2水平明显降低。而最近文献［10］报道，通过对一个70%肝切除的肝脏再生小鼠模型研究发现，Wnt2在触发肝细胞的再生中起一定作用。但本研究所选肝癌病例为术后复发就诊患者，因而肝脏的再生能力较健康人降低，这可能是肝癌患者血清中Wnt2水平较健康人低的原因。

此外，本课题中宫颈癌、卵巢癌、肺癌及肝癌所收集的样本量偏小，因此本课题所得出的结果仅仅是初步的，后续尚需大样本进一步验证。在下一步的试验中，作者将通过组织芯片技术，来检测处于不同临床分期的妇科肿瘤中Wnt2的表达情况，进一步探讨Wnt2在妇科肿瘤中的作用机理，若试验结果证实Wnt2在妇科肿瘤中的表达量与恶性程度相关，作者将在后续试验中进一步收集不同恶性程度的妇科肿瘤患者血清，来证实Wnt2在妇科肿瘤患者血清中的表达与妇科肿瘤恶性程度是否相关，是否能作为妇科肿瘤的筛查、预后评估、预后监测的指标而应用于临床。

［1］Miller JR.The Wnts［J］.Genome Biol，2001，3（1）：1－15.

［2］Park JK，Song JH，He TC，et al.Overexpression of Wnt－2 in colorectal cancers［J］.Neoplasma，2009，56（2）：119－123.

［3］Cheng XX，Wang ZC，Chen XY，et al.Frequent loss of membranous E－cadherin in gastric cancers：A cross－talk with Wnt in determining the fate of beta－catenin［J］.Clin Exp Metastasis，2005，22（1）：85－93.

［4］Clément G，Braunschweig R，Pasquier N，et al.Alterations of the Wnt signaling pathway during the neoplastic progression of Barrett′s esophagus［J］.Oncogene，2006，25（21）：3084－3092.

［5］Widelitz R.Wnt signaling through canonical and non－canonical pathways：recent progress［J］.Growth Factors，2005，23（2）：111－116.

［6］Fu L，Zhang C，Zhang LY，et al.Wnt2secreted by tumour fibroblasts promotes tumour progression in oesophageal cancer by activation of the Wnt／β－catenin signalling pathway［J］.Gut，2011，60（12）：1635－1643.

［7］Brown AM.Wnt signaling in breast cancer：have we come full circle［J］.Breast Cancer Res，2001，3（6）：351－355.

［8］Yu M，Ting DT，Stott SL，et al.RNA sequencing of pancreatic circulating tumour cells implicates WNT signalling in metastasis［J］.Nature，2012，487（748）：510－513.

［9］Jazaeri AA.Molecular profiles of hereditary epithelial ovarian cancers and their implications for the biology of this disease［J］.Mol Oncol，2009，3（2）：151－156.

［10］Ding BS，Nolan DJ，Butler JM，et al.Inductive angiocrine signals from sinusoidal endothelium are required for liver regeneration［J］.Nature，2010，468（7321）：310－315.