MRL／lpr狼疮鼠骨TNF-α／NF-κB信号通路的表达

崔婷，宋冬明，裘影影，芮金兵，吴玲，费小明，李晶，汤郁

（江苏大学附属医院1．风湿科，2．血液科，江苏镇江212001）

MRL／lpr狼疮鼠骨TNF-α／NF-κB信号通路的表达

崔婷1，宋冬明1，裘影影1，芮金兵1，吴玲1，费小明2，李晶1，汤郁1

（江苏大学附属医院1．风湿科，2．血液科，江苏镇江212001）

目的：探讨系统性红斑狼疮小鼠（MRL／lpr）骨肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）／细胞核因子-κB p50（nuclear factor-κB p50，NF-κB p50）信号通路的表达。方法：选取C3He／HeJ小鼠（对照组）和MRL／lpr狼疮小鼠（狼疮组）各6只，饲养4个月后常规制备小鼠股骨组织切片，HE染色观察骨质情况，免疫组织化学染色检测TNF-α、NF-κB p50蛋白表达情况；密度梯度离心法分离和贴壁法筛选骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs），然后培养；免疫细胞化学染色观察BMMSCs中TNF-α、NF-κB p50表达情况。结果：与对照组比较，狼疮组小鼠骨小梁松散，出现骨质疏松，股骨TNF-α和NF-κB p50蛋白表达升高（P＜0．05或P＜0．01），BMMSCs中TNF-α和NF-κB p50蛋白表达亦升高（P＜0．05或P＜0．01）。结论：狼疮鼠骨TNF-α／NF-κB信号通路处于异常活化状态。

系统性红斑狼疮；间充质干细胞；TNF-α／NF-κB信号通路

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是一种慢性的、系统性自身免疫病，累及全身多系统，包括肾脏、心血管系统、神经系统、骨骼肌和皮肤等。近年来，随着狼疮治疗水平的提高，患者的生存率也大幅度提高，但骨质疏松成为影响患者生活质量的主要问题之一［1］。骨质疏松症是一种以骨量减少，骨的微细结构改变，骨的脆性增加致骨折发生率增加为特点的代谢病。骨代谢涉及多种信号通路，如细胞核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信号通路、骨形态发生蛋白（bonemorphogenetic protein，BMP）／Smad信号通路、有丝分裂原激活蛋白激酶（MAPK）信号通路等。研究表明，SLE患者骨质疏松症发病率高［2］。炎症是导致SLE患者发生骨质疏松的主要原因之一。目前研究发现，TNF-α、IL-10等炎症因子主要通过细胞内外的信号通路作用于破骨细胞，致其过度活化，进而造成骨质疏松［3］。但目前关于炎症对SLE患者成骨细胞影响的研究甚少。因此，本研究旨通过动物实验探讨SLE骨TNF-α／NF-κB信号通路的改变。

1 材料与方法

1．1 动物

MRL／lpr雌性狼疮小鼠6只（狼疮组），6～7周龄，体质量（22．1～26．0）g，平均（24．2±0．5）g，购于上海斯莱克实验动物有限公司，动物合格证号：2007000560799。C3He／HeJ雌性小鼠6只（对照组），6～7周龄，体质量（23．6～25．2）g，平均（24．7 ±0．7）g，购于南京大学模式动物实验室，动物合格证编号201302035。小鼠均饲养于江苏大学动物实验中心，自由进食、饮水，饲养条件相同，共4个月。

1．2 主要试剂、仪器

PBS（pH＝7．4）、低糖DMEM、胎牛血清（Gibco公司）；10%EDTA脱钙液购自北京罗基生物公司；兔抗鼠TNF-α多克隆抗体（Abcam公司）；兔抗鼠细胞核因子-κB p50（nuclear factor-κB p50，NF-κB p50）多克隆抗体（Santa Cruz公司）；兔源HRP标记二抗购自福州迈新公司；细胞用玻片、24孔板（Corning公司）。

1．3 方法

1．3．1 骨组织HE染色 两组小鼠采用过量乙醚吸入法处死。取左侧股骨，剔除多余的肌肉组织，10%甲醛固定24 h，转移至脱钙液中，30 d后取出骨头，制成4μm石蜡切片。切片脱蜡至水，伊红染5 min，苏木素染1 min，流水冲洗、盐酸分化、温水返蓝、梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片，置于显微镜下观察并拍照。

1．3．2 骨组织免疫组织化学染色 切片脱蜡至水，PBS洗3次，5 min／次。3%H2O2封闭内源性过氧化物酶10 min，PBS冲洗5 min，3次。室温下0．4%胃蛋白酶修复20 min，PBS洗3次，5 min／次。正常山羊血清室温封闭20 min。分别滴加抗TNF-α、NF-κB p50一抗4℃过夜，PBS洗3次，5 min／次。滴加二抗室温孵育30 min，PBS洗3次，5 min／次。滴加DAB，3min后自来水终止显色。苏木素复染1 min，分化、返蓝、脱水、透明、封片，置于显微镜下观察并拍照。

1．3．3 骨髓间充质干细胞（bonemarrow mesenchymal stem cells，BMMSCs）分离培养 采用密度梯度离心法和贴壁筛选法分离培养小鼠股骨BMMSCs。具体方法详见文献［4］。

1．3．4 BMMSC免疫细胞化学染色 取两组小鼠右侧股骨骨髓，冲洗，得到的细胞用含15%胎牛血清的低糖DMEM培养，融合度达80%时用胰酶消化原代细胞并传代培养，取第3代细胞做细胞玻片。24 h后弃培养液，10%甲醛固定15 min，PBS洗2次，0．5%Triton X-100孵育20 min，PBS洗2次。3% H2O2孵育15 min，PBS洗2次。正常山羊血清室温封闭20 min。分别滴加抗TNF-α、NF-κB p50一抗4℃过夜。PBS洗2次，滴加二抗室温孵育30 min。PBS洗2次。DAB显色3min，自来水终止显色。苏木素复染1 min，分化、返蓝、脱水、透明、封片，置于显微镜下观察并拍照。

1．4 统计学分析

采用IPP软件摄影，计算两组小鼠骨皮质厚度和骨小梁占髓腔体积的百分比；采用SPSS 16．0进行统计分析，数据以均数±标准差±s）表示。方差齐时采用独立样本t检验分析，方差不齐采用非参数统计分析。P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 MRL／lpr小鼠骨组织结构

紧贴骨软骨下取一块组织计算骨松质占骨组织体积比，结果显示，狼疮组小鼠骨小梁占骨组织体积百分比为（21．94±3．01）%，对照组小鼠为（26．96± 3．14）%，狼疮组骨小梁较对照组松散（t＝2．827，P＜0．05）。见图1。

2．2 两组小鼠骨TNF-α、NF-κB p50蛋白表达

免疫组织化学染色结果显示，狼疮组小鼠股骨TNF-α、NF-κB p50蛋白表达明显高于对照组，定量分析显示同样结果。见图2和图3。

2．3 BMMSCs形态

两组小鼠BMMSCs原代培养48 h可见散在贴壁细胞，培养96 h时可见大量放射状的长梭形细胞，符合BMMSCs的形态特征。两组细胞形态无明显差别。见图4。

2．4 两组BMMSCs中TNF-α和NF-κB p50表达

结果显示，狼疮组小鼠BMMSCs胞质、胞核棕色成分明显多于对照组小鼠。定量分析结果显示，狼疮组TNF-α和NF-κB p50蛋白表达明显高于对照组（P＜0．05或P＜0．01）。见图5和图6。

3 讨论

本实验结果显示，狼疮组小鼠骨小梁排列紊乱，骨皮质减少，存在骨质疏松，与Sun等［5］实验结果一致；免疫组化结果进一步显示狼疮组小鼠股骨TNF-α及NF-κB p50表达高于对照组。但从原位的骨组化，尚不能清楚地区分在组成骨的多种细胞中，包括成骨细胞、破骨细胞、间充质干细胞（MSCs），具体是哪一种细胞的蛋白表达减弱。

本实验进一步分离小鼠的BMMSCs，免疫组化染色结果显示，狼疮组TNF-α、NF-κB p50蛋白表达明显高于对照组，间接提示狼疮组小鼠BMMSCs NF-κB信号通路处于较为活化的状态，可能与其处于高TNF-α的炎症环境有关。

成骨细胞来源于BMMSCs。有研究表明，TNF-α可促进BMMSCs成骨分化［6］；也有研究表明，TNF-α可抑制BMMSCs成骨分化［7－9］。前者主要通过NF-κB或者MAPK信号通路来实现［6］。NF-κB信号通路是细胞内参与代谢尤其是骨代谢的一条重要的信号通路，NF-κB p50是该信号通路的重要分子；细胞外的信号分子通过作用于细胞膜上的相应受体，引起细胞一系列的分子变化，进而引起NF-κB p50转位入核，诱导BMMSCs与成骨相关基因的表达。因此，本实验也提示SLE患者骨质疏松的形成可能是由于BMMSCs向成骨细胞分化时，致炎因子改变了信号通路的活性所致。

总之，本研究提示狼疮鼠存在骨质疏松，其骨及BMMSCs NF-κB信号通路活化，骨TNF-α增高，为进一步阐释SLE致骨质疏松的机制提供了依据，也为临床上对SLE患者的靶向治疗提供了参考。限于本实验的研究条件，未能检测NF-κB信号通路上其他分子表达量的变化，其他致炎因子对通路的影响，以及该信号通路与其他信号通路的相互作用。因此，还需要进一步实验来揭示狼疮鼠BMMSCs活化的NF-κB与骨质疏松的因果关系。

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Expression of TNF-α／NF-κB signaling pathway in the bone of system ic lupus erythematosusm ice（MRL／lpr）

CUITing1，SONG Dong-ming1，QIU Ying-ying1，RUIJin-bing1，WU Ling1，FEIXiao-ming2，LIJing1，TANG Yu1
（1．Department of Rheumatology and Immunology，2．DepartmentofHematology，the Affiliated Hospitalof Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212001，China）

Objective：To investigate the tumor necrosis factor-α（TNF-α）／nuclear factor-κB p50（NF-κB p50）signaling pathway in bone of systemic lupus erythematosus mice（MRL／lpr）．M ethods：Six C3He／HeJmice（control group）and six MRL／lprmice（lupus group）were feed，thenmouse femur tissue sectionswere prepared and bone circumstances were observed by hematoxylin-eosin（HE）staining．The proteins of TNF-αand NF-κB p50 were detected by immunohistochemical staining．Bonemarrowmesenchymal stem cells（BMMSCs）were isolated by density gradient centrifugation adherence screeningmethod and cultured，then the expressions of TNF-α，NF-κB p50 were detected by immunocytochemistry staining．Results：Trabecular bone of MRL／lpr lupusmice showed osteoporosis and the percentage of the cortex to the volume of bone of MRL／lprmice were significantly lower compared to control group（P＜0．05）．The protein expression levels of TNF-αand NF-κB p50 on the femur of MRL／lprmice were higher than the C3He／HeJmice（P＜0．05 or P＜0．01）．Immunocytochemistry results displayed that on the BMMSCs of the MRL／lprmice，the protein expression levels of TNF-αand NF-κB p50 were also higher than the C3He／HeJmice（P＜0．05 or P＜0．01）．Conclusion：TNF-α／NF-κB signaling pathway on the bone of lupusmice has been abnormally activated．

systemic lupus erythematosus；mesenchymal stem cells；TNF-α／NF-κB signaling pathway

国家自然科学基金资助项目（81202358）；镇江市社会发展项目（SH2013028）；镇江市学术技术带头人专项基金资助项目

崔婷（1987—），女，硕士研究生；汤郁（通讯作者），副主任医师，硕士生导师，E-mail：cattlemouse＠sohu．com

R593．24

A

1671－7783（2014）05－0380－04

10．13312／j．issn．1671-7783．y140212

2014－07－23 ［编辑］ 刘星星