正交设计法优选三黄油的制备工艺

黄 锐, 蒲清荣, 陈玉兰, 赵 剑, 孟金程, 明俊男

（泸州医学院附属中医医院, 四川 泸州 646000）

正交设计法优选三黄油的制备工艺

黄 锐, 蒲清荣*, 陈玉兰, 赵 剑, 孟金程, 明俊男

（泸州医学院附属中医医院, 四川 泸州 646000）

目的 优选三黄油的制备工艺。方法 在确定加油量的基础上，以盐酸小檗碱为指标，对浸泡时间、药材粗细、提取时间3个影响因素进行考察，采用正交试验法优选三黄油的制备工艺。结果 最佳制备工艺是:药材为细粉， 加入 6 倍量的油， 浸泡 12 h， 提取 60 min。 结论 优选的制备工艺简单可行， 稳定可靠， 具可操作性和重复性。

三黄油;正交设计;制备工艺;盐酸小檗碱;高效液相色谱法

三黄油是泸州医学院附属中医医院自制中药医疗器械三黄油纱条的重要组成部分，含有黄连、黄柏、黄芩、栀子、麻油等成分。三黄油纱条可以对鼻腔黏膜损伤起保护作用，有利于所有需要鼻腔填塞的患者康复，临床上主要应用于鼻腔、 鼻窦治疗行填塞和置放［1-3］。 有相关文献报道通过 GC法测定冰片的量或 HPCE法测定大黄素、 大黄酚的量作为指标来控制三黄油的质量［4-5］。 而黄连、 黄柏作为方中君药，尚未见用盐酸小檗碱的量作为指标来控制三黄油的质量。 课题组参考文献 ［6-9］， 以及多次预试验， 建立 HPLC法测定三黄油中黄连、 黄柏的主要成分盐酸小檗碱的量，优化了三黄油的制备工艺。

1 材料

LC-20AT高效液相色谱仪 （日本岛津）;AUW120D电子天平 （日本岛津）;JP全数字超声波发生器 （武汉嘉鹏电子有限公司）;HH数显电热恒温水浴箱 （江苏国胜实验仪器厂）;101-2AB电热鼓风干燥箱 （杭州汇尔仪器服务有限公司）; 盐酸小檗碱 （中国药品生物制品检定所， 批号为 110713-201212， 供定 量测定用）; 黄连、 黄柏、 黄 芩、栀子药材 （购自四川泸州天植中药饮片有限公司， 经泸州医学院 药 学 院 唐 灿 教 授 鉴 定 为 毛 茛 科 植 物 黄 连 Coptis chinensis Franch.的 干 燥 根 茎， 芸 香 科 植 物 黄 皮 树 Phellodendron chinense Schneid 的 干 燥 树 皮， 唇 形 科 植 物 黄 芩Scutellaria baicalensis Georgia的 干 燥 根， 茜 草 科 植 物 栀 子Cardenia jasminoides Ellis的干燥 成 熟 果 实 均 符 合 《 中 国 药典》 2010 年版一部该药材项下规定）， 麻油; 甲醇、 乙腈为色谱纯，水为纯化水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 盐酸小檗碱的测定

2.1.1 色 谱 条 件 Inertsil ODS-SP C18柱 （ 250 mm ×4.6 mm， 5 μm）; 以 乙 腈-0.05 mol/L 磷 酸 二 氢 钾 溶 液（50 ∶50） （每 100mL中加十二烷基硫酸钠 0.4 g， 再以磷酸调节 pH为 4.0） 流动相， 二元高压梯度， 体积流量 1 mL/min， 柱温 40 ℃， 检测波长 345 nm， 进样量 10 μL， 理论板数按盐酸小檗碱峰计算应不低于 5 000［9-11］。

2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取对照品 0.002 30 g，置 25 mL棕色量瓶中， 加 甲 醇溶 解 并 定容， 得 0.092 mg/mL的对照品贮备液。 精密吸取对照品贮备液 1 mL置于10 mL量瓶中， 甲醇定容至刻度， 摇匀即得对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备 取三黄油 20 mL， 加石油醚（60 ～90 ℃） 50 mL和 1%盐酸溶液 50 mL振摇提取过夜，分取酸水液， 石油醚层再加 1%盐酸溶液 50mL振摇提取 1次， 合并酸水液， 加入石油醚 20 mL萃取， 酸水层用浓氨试液调节 pH至 9 ～10， 用三氯甲烷振摇提取 2 次 （40 mL、30mL） 合并三氯甲烷液， 挥干， 用 1%盐酸甲醇溶液溶解并转移至5 mL量瓶中， 加至刻度， 摇匀， 用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.1.4 阴性对照溶液的制备 精密称取黄芩 6 g， 栀子 6 g， 加入 6 倍量麻油， 浸泡 12 h， 提取 60 min， 冷却， 过滤， 得到不含黄连和黄柏的阴性对照， 按 “2.1.3” 项下方法， 制得阴性对照溶液， 并按 “2.1.1” 项下的色谱条件测定， 结果阴性对照无干扰。结果见图1。

2.1.5 线性关系考察 取 “2.1.2” 项下对照品贮备液0.4、 0.8、 1.0、 2.0、 4.0 mL分别于 10 mL棕色量瓶中，加甲醇定容， 取10 μL注入液相色谱仪， 按照 “2.1.1” 项下色谱条件进行试验，记录峰面积。以峰面积积分值Y为纵坐标， 对照品的进样质量浓度 X（mg/mL） 为横坐标，结果盐酸小檗碱的回归方程为 Y=4.251 ×107X-8.210 × 103， r2=0.999 7 （n=5）， 线性范围为 0.003 68 ～0.036 8 mg/mL， 表明对照品的进样质量浓度与峰面积积分值呈良好的线性关系。

2.1.6 精密度试验 取 “2.1.2” 项下对照品溶液 10 μL，按 “2.1.1” 项下色谱条件测定， 连续进样 6 次， 测得盐酸小檗碱面积 RSD为 1.3%。 表明仪器精密度良好。

2.1.7 稳定性试验 取同一供试品溶液， 分别于0、 2、 4、6、 8、 12、 24 h 进样 10 μL注入液相色谱仪， 测定盐酸小檗碱峰面积， 结果 RSD为 2.1%， 表明供试品溶液在 24 h内基本稳定。

2.1.8 重 复 性试验 取 6 份同 一 批 号 的 三 黄 油， 按“2.1.3” 项下制备供试品溶液， 按 “2.1.1” 项下色谱条件测定盐酸小檗碱峰面积， 结果 RSD为 1.7%， 表明试验重复性良好。

2.1.9 回收率试验 取 “2.3” 项下已知量的正交试验 4号的供试品溶液， 加入 “2.1.2” 项下盐酸小檗碱对照品溶液 3 mL， 按 “2.1.1” 项下色谱条件进行测定， 计算加样回收率。 结果平均回收率为 99.2%， RSD为 1.7%， 说明该方法确实可行。 结果见表1。

表1 加样回收率试验结果

2.1.10 样品测 定 精密量取各样品溶 液 30 mL， 按“2.1.3” 项下方法制备供试品溶液， 按 “2.1.1” 项下色谱条件进行测定， 结果见图1。

图1 盐酸小檗碱高效液相色谱图

2.2 单因素考察三黄油的加油量 通过预试验， 以 1 ∶6、1 ∶8、 1 ∶10 3 种加油比例来对三黄油的加油量进行优化选择。 称取单处方 （黄连 6 g、 黄柏 6 g、 黄芩 6 g、 栀子 6 g）药材量加入 6、 8、 10 倍量麻油， 均浸泡 12 h， 加热提取30min， 冷却， 过滤， 取三黄油测定盐酸小檗碱， 含有量分别为 0.009 24， 0.005 48， 0.003 63 mg/mL， 故选择加油量1∶6作为三黄油的加油量。

2.3 三黄油制备工艺优化

2.3.1 正交试验 根据上述试验结果， 加油量为 1 ∶6， 采用正交试验对三黄油制备工艺的各影响因素进行考察。通过预试验，浸泡时间，药材粗细，提取时间是影响其质量的主要因素，在此基础上，进行正交试验，因素水平表见表 2， 试验安排见表 3， 方差分析见表 4。

表2 正交试验因素水平

由方差分析结果可知，B因素药材粗细程度对于指标具有显著影响，经直观分析，其影响大小的顺序为药材粗细＞提取时间 ＞浸泡时间， 综合考虑， 得优化处方条件为A1B3C3， 即三黄油原药材粉碎为细粉， 加入 6 倍量的麻油，浸泡 12 h， 提取 60 min。

表 3 L9（34） 正交试验

表4 综合评分方差分析

2.3.2 工艺验证 精密称取 3 份三黄油处方中所含的药材（黄连 6 g， 黄芩 6 g， 黄柏 6 g， 栀子 6 g）， 照上述确定的最佳工艺条件制成三黄油， 再按 “2.1.3” 项下方法制备供试品溶液， 按 “2.1.1” 项下色谱条件进行测定。 3 次试验的三黄油所含盐酸小檗碱的含有量为 0.023 39、 0.023 42、0.022 89mg/mL， RSD为 1.3%， 表明该工艺稳定可行。

3 讨论

建立了三黄油中盐酸小檗碱的定量测定方法，排除了麻油对有效成分检测的影响，方法简便，操作可行，可作为工艺质量标准。有文献报道无法用盐酸小檗碱的量作为指标来控制三黄油的质量［4-5］， 而课题组的前期工作中， 也未能检测出盐酸小檗碱相应的吸收峰，或者是重复性较差。经过多次预试验，测定三黄油中盐酸小檗碱的量，关键在于对其供试品溶液的处理，因而对相关工艺进行改进，如比较石油醚与正己烷的 “去油” 效果， “去油” 即在 HPLC检测中为了检测准确，避免油脂类物质堵塞色谱柱，从三黄油中提取出有效成分，而不带入麻油的过程;优选调节pH之前和之后 “去油”; 氨水易挥发， 调节 pH值后应立即加入三氯甲烷进行振摇提取。

油提取温度微沸的温度在 180 ℃以上， 因而黄芩中黄芩苷、栀子中栀子苷之类的有效成分，采用薄层色谱以及HPLC法测定［12-13］， 样品 没 有 出 现 与 之 相 应 的对照品的斑点以及吸收峰。 薄层鉴别［14］可以鉴别出黄芩素， 但 HPLC样品前处理无法完全实现油与黄芩素分离，未能准确测定其含有量。因而采用可以准确定量的盐酸小檗碱作为三黄油制备工艺的评价指标。

综上所述，通过对三黄油进行了相关前处理，可以以盐酸小檗碱相对含有量为指标控制三黄油的制备工艺，方法准确，重复性好，可用于准确评价三黄油的质量。

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2013-10-25

黄 锐 （1986—）， 男， 硕士， 从事中药新制剂研究。 Tel: （0830） 3162253， E-mail:365369747@qq.com

*通信作者: 蒲清荣 （1972 —） ， 男， 副主任中药师， 从事中药新制剂研究。 E-mail:huangrui6136@sina.cn